超高效液相色谱测定烟叶中的糖类化合物及在筛选评价中的应用

刘 欣 李 晶 魏玉玲 宋春满 陈建华 缪恩铭 耿永勤 向 明 田丽梅

(云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650231)

随着烟草基因组计划重大专项第2个五年计划的开展，在未来5年，将以精准育种为核心，以突破品质为关键，着力实现从传统育种手段向以工厂化育种、模块化育种为主体的精准育种的跨越。其中基因编辑素材的筛选评价则是“优质低害”烟草品种培育的重要技术手段。糖类物质是决定烟叶品质好坏的关键化学成分，对烟叶品质有着重要影响[1-2]，一直以来都是烟草化学检测的重要项目[3-4]，也是国内外烟草行业的质量控制内容[5-6]。

糖的测定方法主要有比色法[7-9]、流动分析法[10-12]、光度法[13-14]、气相色谱法(GC)[15-16]、毛细管电泳法(CE)[17-18]和高效液相色谱法(HPLC)[19-22]等。由于比色法、流动分析法和光度法只能测定糖的总量；GC法需要衍生化前处理，操作步骤复杂；液相色谱法由于前处理简单，分离效率好，检测灵敏度高，成为烟草糖类物质分析的重要分析手段，如烟草行业标准方法[23]。但是该方法色谱分析时间较长(>30 min)，前处理步骤较多，无法较好地满足大量样品的快速分析筛选评价需求，因此亟待开发快速分析方法及与之相匹配的前处理方法。

针对以上测定需求，本研究拟开展样品前处理批量化改进处理研究，设计新型样品萃取瓶，同时采用超高效液相色谱进行分离检测，旨在为新鲜烟叶中4种糖类物质(果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖)提供准确可靠、操作简单的快速筛选评估技术。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与试剂

超高效液相色谱系统：ACQUITY UPLC型，配置ACQUITY蒸发光散射检测器ELSD，美国Waters公司；

超纯水处理系统：Milli-Q50型，美国Millipore公司；

电子分析天平：AE240型，精确0.000 1 g，美国Mettler公司；

超声波振荡器：SK5200型，上海科导超声仪器有限公司；

D-果糖、D-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖：纯度>99%，美国Supelco公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；

三乙胺：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

5个基因编辑烟草样品：基因编辑育种工厂；

3个正常烟草样品：云南中烟工业有限责任公司技术中心。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制 糖类物质(果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖)标准溶液：分别准确称取0.5 g的果糖、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖于100 mL的容量瓶中，用80%的甲醇水溶液溶解并定容到刻度，配制成浓度为5.0 mg/mL的4种糖物质的储备液，于4 ℃下避光保存；使用时分别移取合适体积的储备液，用80%甲醇稀释成一系列所需浓度的标准工作液。

1.2.2 色谱分析条件 分析柱为ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相为75%的乙腈(内含0.2% 三乙胺)，流速0.2 mL/min，柱温35 ℃；进样量5.0 μL；ELSD的漂移管温度65 ℃，载气为氮气，载气压力241.32 kPa。

1.2.3 前处理方法

(1) 萃取瓶装置：新型萃取瓶装置主要解决适应于高通量分析的前处理技术，结构包含外套管(含密封圈)和内套管(带0.45 μm过滤筛板)。进行样品前处理时，样品直接加入外套管中，加入萃取溶剂后利用密封圈将内套管固定在管口；进行样品超声处理后，直接压入内套管，溶液通过筛板过滤和内套管相连接的弯管流出，使样品过滤和转移为一步，相较于平常前处理工作(利用注射器取样，放置过滤头，将滤液吸入注射器，过滤头过滤，转移溶液至色谱瓶的多步骤操作)具有较强的优势，可以大大提高前处理效率；另外可以避免操作人员的人为误差，达到前处理的平行性和稳定性。萃取瓶设计：实验室前期设计了一种集样品提取、过滤净化和转移装瓶为一体，可以简化操作步骤，保持样品处理一致性的新型样品萃取瓶，结构见图1。

1. 样品萃取外管 2. 样品 3. 密封圈 4. 过滤筛板 5. 转移弯管 6. 过滤内套管 7. 提取溶剂 8. 样品收集瓶

(2) 前处理方法：基因编辑烟叶样品，去除主干后，105 ℃ 杀青30 min，60 ℃恒温烘干至恒重，粉碎；正常烟草样品按YC/T 381—2010的方法制备。

将样品萃取瓶的外套管固定在离心管架上，称取0.25 g样品到外套管中，加入25 mL的80%甲醇，然后把萃取瓶的内套管卡在外套管的口部，并利用密封圈进行固定，以防止萃取时萃取液的溅出。对外套管种的样品进行超声萃取，恒温超声35 min。

萃取完毕，取出装置，直接下压在瓶口处的内套管，萃取液直接通过内套管的筛板进行过滤，并进入到管内部，过滤的滤液从弯管管口直接流出，用色谱瓶直接进行收集即可供色谱进样，操作一步实现样品的过滤和转移。

1.3 数据处理

数据采用Empower 2数据工作站进行处理。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件

对烟草样品中的糖一般采用水[24]、水—甲醇[25]、水—乙腈提取[22]，如果利用水来提取烟草，由于提取液中存在大量的酸性物质(如柠檬酸、酒石酸等)，会导致蔗糖发生水解，从而影响检测的准确度[26]；据文献[25]报道，采用含有甲醇的水溶液可以在一定程度上避免提取液中二糖和多糖发生水解反应，经试验采用体积比为80%的甲醇水溶液为最优条件。因此本试验中不再优化提取溶剂，直接采用文献[25]优化的提取溶剂比例。

考虑到加热回流提取操作麻烦，所耗时间较长，不予采用；振荡萃取和超声萃取两相比较，超声萃取的效率更优，因此本试验中选用超声萃取为最佳提取方式。

试验表明，称取0.25 g烟草样品，加入80%的甲醇25 mL，超声萃取30 min以上，烟草样品中水溶性糖可提取完全(>98%)。因此本试验中选择用80%的甲醇超声萃取35 min。

2.2 色谱条件优化

ACQUITY UPLC BEH Amide氨基柱是糖类物质分析的常用色谱柱，根据试验需要，选用水和乙腈作为流动相，随着乙腈比例增大，4种糖类物质的峰型可以得到有效改善；试验发现在流动相中添加三乙胺作为改进剂还可抑制色谱峰拖尾。试验表明，用75%的乙腈(含0.2%的三乙胺)为流动相，等度洗脱即可让待测组分达到基线分离。综上所述，结合分离时间和分析效果，本试验中优选色谱分析条件为：75%的乙腈(含0.2%三乙胺)水溶液等度分离。

ELSD是糖类物质检测的常用检测器，由于糖类物质的非挥发性，经过ELSD会产生响应的信号，因此合适的载气量和漂移管温度是ELSD检测器的关键优化参数。载气量的大小会影响雾化器中液滴的形成，影响ELSD检测器的噪音和检测灵敏度；漂移管温度影响了流动相和检测物质的气化程度，会直接影响检测效果和检测限。通过信噪比比较和信号值对比，本研究优选的检测参数为：漂移管温度65 ℃，氮气作为载气，压力241.32 kPa。

2.3 方法线性关系，检出限和定量限

利用优化色谱条件进行分离，图2为4种糖的标准溶液

色谱分析图。从图2可看出，4种糖类物质峰型较好，达到基线分离，分析时间大大缩短，与目前的烟草行业标准相比，每个样品色谱分离时间缩短了3倍。

配制系列不同浓度的标准溶液，在选定色谱条件下进样5 μL，根据测得的峰面积对糖的浓度(mg/mL)进行线性回归，得到回归方程，结果见表1。由表1中可以发现，4种糖类物质在5～250 μg/mL时具有较好的线性，线性相关系数均>0.999，检测限为1.0～3.2 μg/mL，可以满足烟草样品中4种糖类物质的快速分析。

1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麦芽糖图2 4种糖标准溶液色谱图Figure 2 The chromatogram of the standards

表1 4种糖的标准曲线方程、线性范围、相关系数和检出限†Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients, detection limits and quantification limit of 4 analytes

2.4 方法验证实验

在需要考察的样品中进行标准溶液添加(样品含量的0.5，1.0，1.5倍)，进行加标回收率试验，利用优化的方法进行前处理，并按选择的色谱条件进样分析，每个样品进行7次平行测定，4种糖的回收率为91.0%～102.0%，说明方法回收率较为理想，可以进行烟草中糖类物质的测定分析；考察方法的重复性(N=7)，4种糖类物质的日内精密度为1.2%～2.5%，日间精密度为2.0%～3.0%，综上，方法重复性较佳，稳定性较好，适合实际样品检测。

2.5 实际样品分析

选取5个基因编辑烟叶样品(1#为水培成苗期，2#为水培现蕾期，3#为水培开花期，4#为水培结实期，5#为水培病化烟苗)以及正常烟叶样品3个(6#～8#)，按照优化的前处理方法和色谱条件进行分离检测，图3为某水培成苗期新鲜烟叶实际样品色谱图。

从表2中可以发现，在苗期，烟株叶面较小，光合能力较弱，光合产物主要供应烟株生长发育，因此蔗糖等化合物基本处于累计状态；成熟期，大量淀粉累计于烟叶，还原糖等急剧升高。而水培病化烟苗样品(5#)，果糖和葡萄糖含量是异于同期的烟苗的(1#～4#)，可能是代谢通路出现差异后，导致碳氮代谢等基础代谢发生变化，可以进行后续的深入分析。结果表明：利用建立的方法可以对烟苗期以及正常生长的新鲜烟叶中糖类物质进行分析检测。方法前处理简单易操作，分析时间大大缩短，容易实现批量分析，可以应用于大量基因编辑样品筛选评价以及后续烟叶样品的检测分析。

1. 果糖 2. 葡萄糖 3. 蔗糖 4. 麦芽糖

表2 烟草样品中4种糖的检测结果Table 2 The results of the contents of 4 analytes in the real tobacco samples mg/g

3 结论

鉴于糖类物质对于烟草生长情况和品质的重要关系，本研究以基因编辑工厂化育种样品为考察对象，以正常烟苗样品为参照，立足于大量样品快速分析的需求，针对目前方法存在的问题和缺点开发了一种新鲜烟叶中糖类化合物的快速检测方法。结果表明：通过前处理装置的研发和建立，可以大大简化前处理步骤，提高前处理效率，并保证了样品处理的稳定性和平行性；利用超高效液相色谱分析，4种糖类物质能在10 min内达到基线分离，和行业标准相比色谱分析效率提高3倍，新建立的方法的精密度、回收率均可满足烟草样品分析的需求。下一步将进一步应用于烟草基因编辑工厂化育种的评价流程中，扩大样本量的检测，汇总数据，总结规律，为基因编辑功能研究提供重要数据支持和技术手段。