碳源和乙醇调控雨生红球藻生长与虾青素积累

王晓丹，程蔚兰，赵熙宁，史飞飞，杭伟，季春丽，李润植

(山西农业大学 分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801)

微藻是一类单细胞或细胞群体的光自养植物，光合固碳效率高，单位面积或体积生物量大，在适当的条件下，细胞内能够高水平积累具有独特经济价值的化合物，可商业化开发利用[1]。这些高值化合物，包括应对多种胁迫产生的主要代谢物，作为次级代谢物的类胡萝卜素，多不饱和脂肪酸，和以三酰甘油形式储存的油脂[2]。雨生红球藻(H.pluvialis)是一种单细胞绿藻，细胞内能合成积累高水平的虾青素。虾青素是一种高值、有超强抗氧化特性[3]的类胡萝卜素，广泛应用于医药、保健营养品、化妆品、水产养殖、食品和饲料工业[4]。现今，微藻来源的产品(燃料、类胡萝卜素、多不饱和脂肪酸、蛋白质等)价格一般大约3～5倍于其他来源竞争品的市场价格[5]，但市场需求却日益增加，特别是消费者更青睐这些健康、安全、活性成分高的绿色天然产品。天然虾青素正是这样一种产品，其含量可高达雨生红球藻细胞干重的5%[6]。雨生红球藻规模化养殖和虾青素产品已成为国内外相关科学研究和企业研发的热点[7,8]。已有研究表明，在适宜条件下雨生红球藻生长迅速，但细胞积累虾青素少，只有在胁迫条件下，细胞内才高水平积累虾青素[9]。这种生物量增加和虾青素积累不同步的矛盾制约着雨生红球藻的规模化生产的经济效益。前人在氮源[10]、碳源[11]、微藻光生物反应器[12]，雨生红球藻分子发育[1,13]和培养模式(一步法、两步法)[3,5]等方面做了大量的探索研究和实践，但已有雨生红球藻培养技术体系还未完全解决生物量增加和虾青素积累不同步的问题。

为此，本文选用本实验室分离纯化的雨生红球藻(H.pluvialis)株系SX-HP08为试材，采用一步法培养体系，以BG-11为基础培养基，分别以乙酸钠和二氧化碳为碳源，添加少量乙醇，研究环境友好且价廉的乙醇[14]及其与碳源组合对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响，以期获得能够促使雨生红球藻生物量和虾青素积累同步增长的简易培养新方法，为雨生红球藻高效规模化生产提供理论和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 藻种

试验用藻种为本实验室从山西生境自然水体藻样分离纯化的雨生红球藻(H.pluvialis)株系SX-HP08。

1.2 起始接种量及培养条件

用1 000 mL改进的BG-11培养液，在2 500 mL烧瓶中培养用于试验的雨生红球藻种子藻。在(22±1)℃和70 μmol·m-2·s-1的光照条件下，12 h光照：12 h黑暗的光周期，在人工气候箱中培养,每天定时摇瓶3次[15]。取指数生长期的雨生红球藻接种，各处理每个2 500 mL三角瓶(装有1 000 mL培养液)起始接种量均为1.0×105cells·mL-1。

1.3 培养基的成分

BG-11培养基(1 L)含1.5 g NaNO3，4 mg K2HPO4, 7.5 mg MgSO4·7H2O，6 mg C6H8O7，6 mg FeC6H5O7·NH4OH，1 mg Na2EDTA，36 mg CaCl2·2H2O，20 mg Na2CO3，2.86 mg H3BO3，1.81 mg MnCl2·4H2O，0.22 mg ZnSO4·7H2O，0.39 mg Na2MoO4·2H2O，0.08 mg CuSO4·5H2O，0.05 mg Co(NO3)2·6H2O。所用药品均为分析纯。用1 mol·L-1的HCL调节pH到7.1。培养基及器皿121 ℃，0.1 MPa，灭菌20 min。

1.4 试验所用主要仪器设备

紫外/可见分光光度计UV-1601:北京瑞利分析仪器有限公司；自动灭菌器(进口)MLS-3 781 L-PC:日本Panasonic公司; LED型顶置人工气候箱RDN-560E-4: 中国宁波东南仪器有限公司；pH酸度计PHS-3C:中国上海仪电科学仪器股份有限公司；双人单面洁净工作台SW-CJ-2FD：上海博讯公司；Beckman Allegra X-30R台式冷冻离心机:美国贝克曼﹒库尔特公司; OLYMPUS BX53研究级正置荧光显微成像系统：日本奥林巴斯公司；水分测定仪Sartorius Moisture Analyzer,MA150：德国赛多利斯公司；冻干机ALPHAI-4LDPLUS：德国Christ公司；SHB-III 循环水式多用真空泵：北京科伟永兴仪器有限公司。

1.5 试验处理设置

对照组：BG-11培养基+1.5 g·L-1无水乙酸钠[16]；BG-11培养基+1 h通入60 L占空气体积为0.06%的CO2[15]。

处理组：在上述对照组中分别起始加入3%(v/v)无水乙醇，之后每培养3 d新加入1.5 mL无水乙醇[17]于藻液中。处理组标记为：(BG-11培养基+1.5 g·L-1无水乙酸钠)+乙醇；(BG-11培养基+1 h通入60 L占空气体积为0.06%的CO2)+乙醇。

所有对照和处理组均培养14 d，每组试验重复6次。

1.6 藻细胞生长测定

生物量测定，取整数体积的藻液用玻璃砂芯真空泵抽滤后，通过水份测定仪(Sartorius Moisture Analyzer,MA150)测定干重法。细胞数量通过韦韬[15]的方法，使用改进的鲍尔细胞计数器(血球计)进行细胞计数法测定。每48 h取样测试。

1.7 藻细胞虾青素含量测定

整数体积的雨生红球藻藻液进行离心，获得的藻球进行冷冻干燥。干燥后的细胞先用5% KOH(溶剂是30%的甲醇)溶液去除叶绿素。再用二甲亚砜反复提取直到藻球变为无色。通过分光光度计测定虾青素含量[18]。混合提取物在490 nm处测定吸光度，二甲亚砜用于空白测定。每48 h取样测试。计算虾青素含量的公式如下：

C(mg·L-1)=(4.5×OD490×Va)/Vb

式中，C代表虾青素含量；Va代表二甲亚砜的体积；Vb代表用于测量的雨生红球藻样品的体积。

1.8 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同碳源和添加乙醇对雨生红球藻生长的影响

不同碳源对照组和添加乙醇处理组连续培养14 d，每2 d取样检测藻液细胞密度(表1)。结果显示，乙酸钠为碳源对照组在各检测时段的细胞密度均高于二氧化碳为碳源的对照组。添加乙醇的乙酸钠处理组和添加乙醇的二氧化碳处理组在各检测时段藻液细胞密度均显著高于相应的对照组(P<0.05)。尤其是乙酸钠+乙醇处理组在第4天时，细胞密度上升到最大值(1.587×106cells·mL-1)，而乙酸钠为碳源对照组细胞密度峰值(1.187×106cells·mL-1)出现在第8天。二氧化碳 + 乙醇处理组和二氧化碳为碳源的对照组最大细胞密度分别出现在第6天(1.236×106cells·mL-1)和第14天(7.9×105cells·mL-1)。显然，添加乙醇显著促进了雨生红球藻在培养初期阶段的生长速率。

表1不同碳源和添加乙醇对雨生红球藻生长的影响

Table1 Effect of different carbon and ethanol addition on growth ofH.pluvialis

时间/dTime细胞个数/104cells·L-1CellnumbersCO2CO2+ethanolsodiumacetatesodiumacetate+ethanol010±0.32a10.0±0.14a10.0±0.37a10.0±0.51a227±1.35d68.1±1.87b39.8±2.26c89.4±4.28a431±2.11d112.3±4.6b48.1±3.53c158.7±7.2a643±3.56d123.6±7.5b53.2±1.94c156.8±2.5a856±2.31c119.3±4.8b118.7±5.4c156.1±6.3a1063±1.87c118.7±6.7b117.3±6.2b148.9±9.8a1270±4.56c117.8±5.2b116.8±5.3b147.6±5.4a1479±3.91d115.9±8.2b109.5±8.4c146.4±3.4a

注：同行不同小写字母表示在0.05水平下有显著性差异。下同。

Note: Different small letters show significant difference at the 0.05 level in the same row.The same below.

2.2 不同碳源和添加乙醇对雨生红球藻生物量的影响

表2显示不同碳源和添加乙醇处理连续培养14 d雨生红球藻生物量积累量。各处理雨生红球藻生物量随培养时间延长逐渐增加。在各测试阶段，添加乙醇的乙酸钠和添加乙醇的CO2处理组藻细胞生物量均显著高于对照组(P<0.05)。在第14天时，处理组生物量(2.74 g·L-1和2.59 g·L-1)分别是乙酸钠和CO2对照组生物量(0.92 g·L-1和0.7 g·L-1)的2.98倍和3.7倍。生物量高低顺序为：乙酸钠+乙醇>CO2+乙醇>乙酸钠>CO2。

表2不同碳源和添加乙醇对雨生红球藻生物量的影响

Table2 Effect of different carbon and ethanol addition on biomass ofH.pluvialis

时间/dTime生物量/g·L-1BiomassCO2CO2+ethanolsodiumacetatesodiumacetate+ethanol00.12±0.02a0.12±0.01a0.12±0.01a0.12±0.03a20.18±0.01d0.56±0.05b0.29±0.01c0.98±0.04a40.21±0.03d0.87±0.04b0.40±0.03c1.37±0.04a60.39±0.01d1.37±0.03b0.47±0.01c1.75±0.19a80.48±0.03d1.50±0.05b0.69±0.09c1.95±0.26a100.59±0.05d1.98±0.14b0.72±0.05c2.27±0.21a120.68±0.04d2.38±0.13b0.89±0.04b2.67±0.30a140.70±0.01d2.59±0.10b0.92±0.04c2.74±0.06a

2.3 不同碳源和添加乙醇对雨生红球藻虾青素积累的影响

对各处理连续培养14 d不同时段雨生红球藻细胞虾青素含量测试结果(表3)显示，添加乙醇的乙酸钠和添加乙醇的CO2处理组藻细胞虾青素含量在培养早期就高于对照组。从第8天开始，处理组细胞虾青素积累大幅快速增加，而对照组藻细胞虾青素积累缓慢。至培养14天时(表3和图1)，处理组藻细胞虾青素含量(96.1 mg·L-1和80.2 mg·L-1；3.51%和3.10%,干重)是乙酸钠和CO2对照组藻细胞虾青素含量(18.9 mg·L-1和10.0 mg·L-1；2.05%和1.43%,干重)的1.71倍和2.17倍(干重)，处理组与对照组差异达极显著水平(P<0.01)。

表3不同碳源和添加乙醇对雨生红球藻虾青素积累的影响

Table3 Effect of different carbon and ethanol addition on astaxanthn accumulation inH.pluvialiscells

时间/dTime虾青素产量/mg·L-1AstaxanthinyieldCO2CO2+ethanolsodiumacetatesodiumacetate+ethanol01.25±0.57a1.25±0.05a1.25±0.08a1.25±0.04a21.90±0.52d6.79±0.32b4.30±0.14c12.90±1.24a42.60±0.13d10.97±0.74b5.80±0.24c19.20±0.94a64.80±0.25d16.90±0.94b7.90±0.32c30.80±1.23a86.00±0.57d20.90±1.07b13.40±0.81c40.90±3.56a108.00±0.72d41.20±3.56b14.00±0.74b51.30±1.94a129.30±0.77d67.30±3.69b17.60±1.55b75.30±3.29a1410.00±0.50d80.20±4.28b18.90±0.62c96.10±8.40a

图1 培养14 d时雨生红球藻各处理组虾青素含量Fig.1 Astaxanthin content in H. pluvialis cultured for 14 days in all treatments

3 讨论与结论

商业化培养雨生红球藻和生产虾青素，通常采用氮、磷等营养素缺乏[10]、高密度光照[19]和高温[20]诱导细胞合成积累虾青素[21]。也有添加一些抑制剂和植物激素来提高虾青素的生产量[22]。但是，这些逆境条件、因素亦严重阻抑藻细胞的生长和生物量的增加，规模化虾青素生产的效益和成本欠佳。

在众多有机物中，乙酸钠最容易被雨生红球藻细胞吸收和利用，能显著促进雨生红球藻细胞的生长[11,23,24]。龙元薷等[25]研究表明，在光照条件下，乙酸钠作为碳源，雨生红球藻进行兼养生长的生物量几乎等于光合自养生长的生物量和异养生长的生物量的总和。Kang等[26]也报道乙酸钠能促进雨生红球藻生长和虾青素的积累。董庆霖等[27]研究指出乙酸钠作为碳源导致雨生红球藻代谢途径所需氮源供应不足而促进虾青素积累。本文研究结果显示，与CO2作为碳源相比，乙酸钠作为碳源不仅能显著促进雨生红球藻细胞生长，而且提高了藻细胞虾青素积累量,与前人的研究结果一致[23，28,29]。这些结果表明，乙酸钠可作为雨生红球藻规模化培养生产虾青素的良好碳源。

Guijarro 和Lagunas报道乙醇能通过简单扩散作用通过细胞质膜，进入细胞内[30]。基于对人类和其他哺乳动物的研究认为，进入细胞内的乙醇可经由乙醇脱氢酶在线粒体复合体Ⅰ和Ⅲ中产生ROS(活性氧)，导致细胞产生相应胁迫[31]。Wen等[32]报道在两步法培养雨生红球藻的第二步缺氮培养基中加入乙醇能促进虾青素的积累。也有报道乙醇能提高红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)中虾青素的产量[33]。黄达明等[34]报道乙醇对小球藻(Chlorella)的生长亦有促进作用。

本研究发现，分别在乙酸钠和CO2为碳源的培养基中添加少量乙醇能显著提高雨生红球藻生长速率和藻细胞内虾青素合成积累量，特别是乙酸钠为碳源添加乙醇处理促进藻细胞生长和虾青素积累正效应更显著。综合前人报道和本研究结果，证明环境友好和价廉的乙醇是继乙烯的前体物(1-氨基环丙烷-1-羧酸[35])之后，又一种既能促进雨生红球藻生长又能促进虾青素积累的优异促进剂，可进一步用于建立优化的雨生红球藻规模化培养和虾青素生产体系。

乙酸钠是雨生红球藻养殖的优异碳源，在不同碳源培养基中添加少量乙醇可显著促进雨生红球藻生长和藻细胞虾青素积累。乙酸钠为碳源添加乙醇可进一步应用于建立优化的雨生红球藻规模化培养和虾青素生产体系，减低虾青素生产成本和提高生产效益。

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