九肽—1纯化方法研究

苏晨灿　张忠旗　赵金礼等

摘要：本研究运用高效液相色谱，通过对九肽-1粗品采用反相聚合色谱柱分离纯化、DEAE柱脱除三氟乙酸，获得了九肽-1纯品，结果表明，所得九肽-1收率为79%，纯度高于99%。

关键词：九肽-1；高效液相色谱；纯化；离子交换

OOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.02.175

九胜肽1又名美立肽，为含有九个氨基酸的美白九肽，主要用于美白亮肤及祛斑。九肽1是一种仿生肽，它和黑色素细胞上的MCl受体有非常好的匹配性，因此可以作为促黑色素细胞激素的对抗剂，竞争性的与MCl受体结合，阻止酪氨酸酶进一步被激活而产生黑色素。九肽1竞争性的封闭黑素母细胞上受体与各种因子信号的入口，弱化了黑素母细胞的活性，减少黑素产生量，14天开始逐步均匀肤色，一个皮肤周期28天后，明显提亮肤色，呈现肌肤红润、白皙，因此九肽-1常被用作化妆品原料。

九肽1作为化妆品原料时HPLC纯度≥99%，然而通过合成得到的九肽-1粗品中含有很多杂质，需要进一步提纯后才可以作为化妆品原料。

1实验部分

1.1试剂与仪器

乙酸（分析纯天津市福晨化学试剂厂提供）、氢氧化钠（分析纯天津市红岩化学试剂厂）、乙酸钠（分析纯天津市天力化学试剂有限公司）、氯化钠（分析纯国药集团化学试剂有限公司）甲醇（色谱纯宿松龙华精细化工有限公司）、乙腈（色谱纯TEDIA COMPANYINC.）、三氟乙酸（色谱纯TEDIA COMPANY INC.）、微孔滤膜（0.45μm上海市新亚净化器件厂）、九胜肽1粗品（陕西慧康生物科技有限责任公司固相合成）、超纯水。

制备高效液相色谱仪（创新通恒LC3000）、分析高效液相色谱仪（日立全自动L2000系列）、C18分析色谱柱（大连物理化学研究所4.6mm×250mm）、反相聚合物柱（自填体积为300mL成都科谱生物有限公司填料F型粒径为30～50}μn的SBC MCI GEI反相色谱填料由提供）、纯水机（北京爱思特克科技开发有限责任公司CSR-4-10）、超声波清洗器（昆山市仪器有限公司KQ-500B）、旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂RE-52AA）、冷凍干燥机（北京博医康实验仪器有限公司FD-1C-50）、循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司SHB-Ⅲ）、双级旋片式真空泵（上海河山泵业有限公司2XZ-4）。

1.2实验过程

（1）样品溶解。将九胜肽-1粗品溶解于水溶液中，超声分散，用滤膜过滤，收集滤液；

（2）粗品分析及程序优化。取1.2.1所得滤液0.1mL用水溶液稀释至1mL，用C18分析柱进行分析。

分析及程序优化条件：流动相：A相为体积比0.1%三氟乙酸/水；B相为体积比0.1%三氟乙酸/乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；洗脱时间：30min；洗脱梯度：B相浓度从10%-90%；根据粗品分析所得结果进行程序优化：洗脱梯度从B相浓度10%-90%逐步优化至25%-55%。

（3）纯化。以优化程序为参考用反相聚合物制备柱对过滤后的九胜肽-1粗肽溶液进行纯化。

纯化条件：流动相：A相为体积比0.1%三氟乙酸/水B相为体积比0.1%三氟乙酸/甲醇；检测波长：215nm；流速：20.0mL/min；进样量：10mL；洗脱时间：50min；洗脱梯度：B相浓度45%-60%；收集目标物馏分并进行分析，分析条件同粗品分析，洗脱梯度：B相浓度25%55%，将纯度>99%的馏分合并，减压蒸馏浓缩，待用。

（4）除三氟乙酸。将纯化后的浓缩液使用DEAE弱阴离子交换柱脱除三氟乙酸。

除三氟乙酸条：流动相：A相为2%醋酸；检测波长215nm；流速：8.0mL/min；洗脱时间：50min；洗脱梯度：100%A相等度洗脱；收集目标物馏分，减压蒸馏浓缩，待用。

（5）成骨五胜肽纯品分析及质谱确认。将1mg九肽-1纯品冻干粉溶解于1mL水溶液中。分析条件同粗品分析，洗脱梯度：B相浓度25%-55%。取1mg九肽-1纯品送第四军医大学进行质谱测定。

2结果与讨论

2.1粗品分析及程序优化

九肽1粗品分析及程序优化图如图1所示，其中图1为根据粗品保留时间、纯度及峰型，进行三次程序优化后得到的分析图：分析程序优化到洗脱梯度B相浓度25%-55%时，粗品中所含杂质峰与目标物明显分离开来，该程序可以为纯化提供参考。

2.2纯化

九肽1纯化后的分析图如图2所示，B相浓度45%-60%进行纯化时，杂质峰完全分离，且纯化后目标物纯度>99.0%。实验证明该纯化条件用于九肽1粗品纯化具有很好的适用性。

2.3冻干粉纯度分析

冻干后称得九肽-1纯品，纯化收率为79%。其中图3为九肽-1纯品冻干后的色谱表征图，纯度为99%。

3结论

本方法打破了直接运用反相高效液相色谱法进行反复纯化的传统多肽纯化方法，将反相聚合物柱与弱阴离子交换柱结合使用，先对九肽-1进行粗纯，除去了大部分杂质，再用弱阴离子交换柱进行脱盐，将三氟乙酸型九肽-1转换成醋酸型九肽-1，并进一步纯化了多肽，极大地提高了纯化效率，节省了整个纯化过程中流动相的成本，且纯化工艺较为环保。本方法粗纯过程中使用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸甲醇溶液做流动相，甲醇用量少且价格低廉，对环境污染小，两种柱子交替使用，有效地弥补了单一柱子难以完全分离粗肽中不同结构、不同化学性质的杂质，得到的九肽-1纯度高（大于99%），且收率高。