脆红李“火烧叶”病原鉴定

伍文宪，刘 佳，张 蕾，黄小琴，刘 勇*

(1.四川省农业科学院植物保护研究所，农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066；2.四川省农业科学院园艺研究所，四川 成都 610066)

【研究意义】脆红李(PrunussalicinaLindl.)属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)果树，是四川省乐山地区选育的一个地方李品种，该品种果实外观艳丽、肉质硬脆、可溶性固形物含量高，具有较强的市场竞争力，该品种成熟期较晚，错开了李子集中上市的季节，且较耐贮运[1]，正因为有上述诸多优势，果农对脆红李种植热情高涨，已成为四川地区主栽的晚熟李子品种。2016年5月，笔者在四川省宣汉县庙安乡、阆中县文成镇等地调查发现一种十分严重的病害，发病面积不断扩大，受害叶片从叶缘开始发病，渐向叶片内部扩展、蔓延，导致叶片枯死凋落，由于感病叶片病斑为红褐色，发病后期叶片失水，叶缘乃至整个叶片焦枯，远看叶片呈火烧状，因此果农将此病征称为“火烧叶”，该病害严重发生时，极易造成李树整株叶片枯死，提早脱落，从而削弱树势，降低果实产量和品质，严重者甚至导致整株绝产绝收。因此，确定脆红李“火烧叶”病的病原，制定针对性的防治方案，对促进四川省脆红李产业发展具有重要意义。【前人研究进展】前人对脆红李的相关研究多集于高产栽培和高效种植管理，而病虫害防控相关的研究相对滞后，脆红李“火烧叶”病害是近年来爆发的新病害，对该病害的研究鲜有报道。【本研究切入点】“火烧叶”病害传染性强、影响面广、破坏性大，明确其病原是有效防控该病害的基础。【拟解决的关键问题】笔者从2016年6月起多地多次采样，经镜检，室内病原分离纯化培养，致病性测定，并用分子生物学结合传统形态学方法进行了病原菌的分离和鉴定工作，为科学防治脆红李“火烧叶”奠定基础。

1 材料与方法

1.1 叶病采集与症状描述

2016年6月至2016年8月，选择四川宣汉县庙安乡、阆中县文成镇、丹棱县城郊等地发病严重的果园采集脆红李“火烧叶”病样，每个果园随机选取5株发病植株，每株树按东、南、西、北4个方位随机选择10片发病较轻和10片发病较重的叶片，用自封袋装好放入便携式冷藏盒，带回实验室备用。

1.2 病样检镜与分离培养

采用常规方法对发病的脆红李叶进行显微镜观察，如观察到分生孢子，则用无菌水将病样组织的孢子洗下，稀释适当倍数后将该孢子悬浮液转移涂布于同时含有链霉素(50 μg·mL-1)和氨苄青霉素(100 μg·mL-1)的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar， PDA)中培养48 h左右，分生孢子萌发在培养基上形成微小菌落，用灭菌的接种针将单菌落菌丝移入另一PDA培养基上培养，获得病原菌的单孢纯化菌株[2]。如病样在显微镜下未观察到分生孢子，则用无菌剪刀取切病健交界处的病斑组织成0.5 cm×0.5 cm的小片，采用三步法进行消毒，然后用无菌水清洗3次。灭菌滤纸上充分吸干水分后置于含有链霉素和氨苄青霉素PDA培养基平板中，将平板置于25 ℃恒温培养箱中培养，待菌丝生长后，从新长出的菌落边缘挑取少量菌丝接种到新的 PDA平板上进一步分离[3]。

1.3 致病性测定

选择大小一致、健康无病、无虫伤的脆红李叶片，进行离体叶片接种试验。叶片用70 %乙醇进行表面消毒，晾干后置于保湿培养皿(直径150 mm)中，每皿4～5片叶片。用无菌水冲洗继代培养后供试菌株上的分生孢子，将分生孢子稀释至106个孢子/mL，吸取孢子悬浮液20 μl滴在叶片靠近边缘处接种，同时接种无菌水作为对照，6次重复。置恒温恒湿培养箱下诱导发病，每天观察发病情况[4-5]。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 形态学鉴定 光学显微镜下观察分离培养获得的病原菌菌丝、分生孢子形态及色泽特征，观察叶上片菌落正反面特征。记录病原菌形态，使用显微镜自带软件测量病原菌分生孢子大小，根据病原菌的产孢特征及其在PDA培养基上的形态特征，参照《真菌鉴定手册》[6]对病原菌进行鉴定。

1.4.2 分子生物学鉴定 根据菌落培养性状和分生孢子形态特征，可初步判断病原菌属于链格孢属(Alternariasp.) 真菌。为准确鉴定病原菌种属，本文对病菌进行了分子鉴定。

切取0.5 cm大小的新鲜菌丝块于铺有玻璃纸的PDA平板上，置于25 ℃黑暗培养5 d后，进行菌丝收集、液氮速冻和研磨，采用真菌基因组E.Z.N.A.TMFungal DNA Mini Kit(OMEGA真菌基因组DNA提取试剂盒)提取病原菌基因组DNA。用引物ITS4与ITS5[7](ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′; ITS5:5′-GGAAGTAA AAGT CGTA ACAAGG-3′)以及PG3和PG2[8-9](PG3:5′-TACCATGGTTCTTTCCGA-3′; PG2:5′-RCARTCRTCYTGRTT-3′)进行PCR扩增。反应总体积为50 μl，反应体系为：25 μl 2×supermix(北京全式金生物技术公司)，2 μl模板DNA，10μmol·L-1的引物(成都擎科梓熙生物技术有限公司)各2 μl，ddH2O补足到总体积，用BIO-RAD T100TMPCR扩增仪进行扩增反应，其反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，总计35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

扩增产物于1.0 %琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上检测，ITS4/ITS5引物扩增产物约为570 bp期望片段，PG3/PG2引物扩增产物约为500 bp，紫外灯下切取目的基因片段，使用凝胶纯化试剂盒(AXYGEN公司提供)纯化后连接到 pMD18-T 载体(大连TaKaRa公司提供)上，转入大肠杆菌 DH-5菌株(北京全式金生物技术公司)，经菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆测序，获得的序列到https://blast.ncbi.nlm.nih.gov进行比对，根据病菌的形态特征、培养性状和致病性，结合序列分析，对病原菌进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 病害症状和危害性

2016年5-9月对发病严重的脆红李果园进行持续观察，发现病原菌首先从叶缘或者叶尖开始侵入，受害叶片表现为叶缘或叶尖失绿泛红，病斑近圆形、椭圆形或不规则形，病斑常沿支脉、侧脉和主脉向叶片内部扩展。后期病斑连成一起，整片叶的边缘均受害呈红褐色，感病时间较长叶缘部位失水后枯焦，叶片逐渐卷曲，背面可见褐色霉层，最终叶片枯萎凋落，由于叶片感病后表现为红褐色病斑，远看叶片呈火烧状，因此果农将此病征称为“火烧叶”。严重受害的脆红李植株不仅叶片枯焦脱落，病原菌还侵染枝干，表现为枝干韧皮部、髓腔失水变褐，导致枝条枯死，严重削弱树势。果实感病初期出现红色斑圈，果面完整无凹陷，后期果实变软，果柄失水萎缩，果实未成熟即脱落，严重降低果实产量和品质，甚至导致绝收。

2.2 病原菌的态学特征

脆红李“火烧叶”叶病保湿培养3 d后刮取病斑上的病原物进行显微镜观察，发现有2种不同的分生孢子，一种为典型的链格孢菌属(Alternariasp.)真菌分生孢子，另一种为炭疽菌属(Colletotrichumsp.)真菌分生孢子，链格孢菌属分生孢子梗单生或簇生，顶端微弯曲，有分隔，色泽为淡褐色和深褐色不等，分生孢子形状变化极大，呈倒梨形、近椭圆形，倒棍棒形、卵形或纺锤形，单生或短链生，褐色，具纵横隔膜，大小为(5.0～13.5) μm× (15.5～45.5) μm，平均为7.5 μm×28.5 μm，喙柱状或锥状。炭疽菌属真菌分生孢子圆柱形，近椭圆形，无色，单孢，大小为 (2.5～4.5) μm× (9.0～19.5) μm，平均为4.0 μm×16.0 μm。

单孢分离获得的链格孢纯培养菌株27个，炭疽菌纯培养菌株14个，人工培养条件下2种真菌产生的分生孢子形态与病样直接镜检观察一致。在PDA培养基上，链格孢菌落灰色至橄榄色或淡褐色，平均生长速率8.7 mm·d-1，菌丝发达，灰色至淡褐色不等，显微镜下观察菌丝有隔膜，多分枝，PDA培养基上不易产孢。PCA或TWA+WS(或滤纸)培养基，在光(日光灯和近紫外光灯)、暗交替条件下培养10 d左右，即可检查到大量分生孢子的产生[10]。27株链格孢菌分生孢子梗和分生孢子形状与大小一致，根据这些特征，初步确定链格孢菌为交链格孢Alternariaalternata(Fr.:Fr.) Keissler。

菌落呈鼠灰色的炭疽菌属真菌较链格孢菌生长快，在PDA培养基上菌落呈圆形生长，边缘整齐，平铺，菌丝初期为白色，后变深灰色，絮状或绒状，后期菌落中央涌出橘红色奶油状分生孢子团。根据上述炭疽菌培养性状和形态学特征，参照相关文献的描述[11-12]，初步确定为胶孢炭疽菌(Colletortrichumgloeosporiodes)。

2.3 致病性测定

基于分离得到的链格孢和炭疽菌形态学与培养特性一致，因此本研究选取链格孢菌AA5和炭疽菌CG9菌株进行致病性测定。结果表明，链格孢菌孢子悬浮液接种脆红李新鲜叶片后，72 h即可萌发成菌丝，10 d后可观察到近圆形红褐色病斑，随着时间的推移病斑形成红褐色轮纹逐渐向外扩展。链格孢孢子悬浮液接种脆红李叶片发病率高达100 %，接种青脆李叶片的发病率为43.0 %，且较脆红李叶片发病时间晚5 d。为了证实病原物上检测到的胶孢炭疽菌是否也是“火烧叶”的致病菌之一，笔者使用同样的方法接种106个孢子/mL胶孢炭疽菌CG9菌株孢子悬浮液，接种后的炭疽菌孢子悬浮液虽能萌发成菌丝，但叶片没有观察到任何病变。

A：整株症状；B：感病叶片；C：发病叶片病斑上的分生孢子；D：病原菌在脆红李叶片叶片上的致病性测定；E、F：分生孢子梗及分生孢子；G：分生孢子；H、I：分生孢子侧面萌生次生分生孢子梗A，B:Symptoms in field; C:The conidia of nature infected leaves; D:Symptoms of Prunus salicina Lindl. CV. Cuihongli leaves after inoculation with Alternaria alternate; E，F：Conidiophores of mycelium and conidia; G:Conidia on TWA+WS plate; H, I:Side germination of secondary conidiophores from conidia图1 脆红李“火烧叶”病害的典型症状、病原菌形态特征及致病性测定Fig.1 Symptoms of ‘flaming leaves disease’ caused by Alternaria alternate and morphology of the pathogen

2.4 病原菌分子生物学鉴定

以真菌核糖体基因转录间隔区通用引物 ITS4/ITS5以及链格孢菌的多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列的兼并引物 PG3/PG2对链格孢菌AA5进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收、克隆和测序后，将2条片段序列登录到http://www. ncbi.nlm.nih.gov数据库中进行比对，发现由引物ITS4/ITS5扩增的ITS1-5.8SrDNA-ITS2片段与细极链格孢(Alternariatenuissima；登录号：LC134323)、交链格孢(Alternariaalternata；登录号：KX384640.1)、芸薹链格孢(Alternariabrassicicola；登录号：KU293595.1)的同源性均达到100 %。由引物 PG3/ PG2扩增的多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列片段与交链格孢(A.alternata)的多聚半乳糖醛酸酶基因 (aapg-1) (登录号：AB047682) 的相似度高达99.9 %，与陈昌胜等[4]报道的红橘褐斑病病原MDB1(A.alternata)多聚半乳糖醛酸酶基因片段(登录号：HQ641564)相似度达99.6 %，与其他种的链格孢菌相似度较低。因此，分子鉴定结合形态学和培养形状，脆红李“火烧叶”病原鉴定为交链格孢Alternariaalternata(Fr.:Fr.) Keissler。

3 讨 论

通过对脆红李植株“火烧叶”病害症状的系统观察，以及对分离病菌的形态学、培养性状以及致病性研究，初步确定“火烧叶”病原为交链格孢菌(Alternariaalternata)，为了进一步确认病原，采用真菌分子鉴定通用引物ITS4/ITS5对病原菌ITS1-5.8SrDNA-ITS2片段进行扩增，以期对ITS序列分析验证形态学鉴定的结果[14]，结果表明交链格孢、细极链格孢和芸薹链格孢ITS区rDNA的序列差异很小，不能根据对所选ITS区的序列分析加以区分。伍文宪等在对镰刀菌分子鉴定时也同样遇到ITS序列并不是总有足够多的位点来区分所有的病原菌问题[15]，需针对交链格孢设计特异性引物加以鉴定，根据Peever等[8]的研究，链格孢菌的多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列可作为小孢子型链格孢菌种的分类鉴定的分子依据，因此采用多聚半乳糖醛酸酶基因部分序列的兼并引物PG3/PG2对脆红李“火烧叶”病原进行扩增，NCBI数据库比对结果表明，引起脆红李“火烧叶”的病原为交链格孢菌(A.alternata)，与形态学鉴定结果一致。

在病原菌分离过程中虽然也能分离到胶孢炭疽病菌(C.gloeosporioides)，但致病性测定结果未能证实该真菌的致病性。Marín等的文献报道认为胶孢炭疽菌普遍存在于健康无症的果树叶片等组织[16]，因此笔者认为，伴随交链格孢存在的胶孢炭疽菌并非是“火烧叶”的真正致病菌，而极可能是脆红李在交链格孢为害后，潜伏的炭疽菌生长发育产孢，其结果可能加重病害的发生。

交链格孢(A.alternata)是一个对植物基质具有广适性的链格孢种，广泛分布自然界中，在自然情况下常生于植物的枯死部分(病斑、伤、死部位等)或衰弱濒死组织上，或腐生于多种有机物质或土壤中[10]，因此人们在病害研究过程中认为交链格孢菌仅是腐生真菌，或是其他病原菌侵染之后的寄生菌，往往忽视交链格孢的重要作用。本研究的实验结果表明交链格孢菌在特定的条件下亦能成为某些植物的重要致病菌，且交链格孢菌具有极强的、多变的环境条件和基质适应能力，在生产实际中防治难度大，在此望引起研究人员的重视。

实地调查“火烧叶”病害及室内致病性测定实验中发现，发病园区的脆红李“火烧叶”病害发病率达70 %以上，而青脆李的发病率在5 %以下，室内接种交链格孢菌，脆红李叶片发病率高达100 %，而接种青脆李叶片的发病率只有43 %，并且较脆红李叶片发病时间晚5 d。以上数据表明脆红李较青脆李抗性差，因此，当地在大力推广脆李种植的同时，还需在品种选择上加以审慎考虑。

4 结 论

经病原菌柯赫氏法则鉴定、形态学鉴定、和分子生物学鉴定，回接病原等实验，确定四川省宣汉县、阆中县等地的脆红李“火烧叶”病原菌为交链格孢菌，建议脆红李大面积种植地区，注意加强注重对该病原菌引起的“火烧叶”病进行及时有效的防控。

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