海洋柴油降解细菌的筛选鉴定及其生物表面活性剂特性

马斌斌，马恒轶，李少君，邓欢欢*

(1.温州医科大学 公共卫生与管理学院，浙江 温州 325035； 2.浙江省流域水环境与健康风险研究重点实验室，浙江 温州 325035；3.温州伟明环保能源有限公司，浙江 温州 325000)

生物表面活性剂是由微生物细胞产生的具有特殊生物活性的物质，可有效地降低空气—水、油—水和固—液之间的界面张力[1]。生物表面活性剂不但囊括了化学合成表面活性剂的所有特性，而且还具有分子结构多样、选择性广泛，无毒、对生态环境友好，可生物降解，在高温、高盐、高pH等极端环境下能稳定存在并发生作用的特性，临界胶束浓度低，且发酵原料在自然界分布广泛，是典型的“绿色”生产，在除油和生物生态修复方面具有巨大的应用潜力[2]。

海洋是地球上最大的生物圈，约占地球总面积的70%，蕴藏着丰富的微生物资源，为人类生存提供了巨大的生产资源，是人类在地球上赖以生存的最重要的物质条件之一，然而它正遭受着人类生活和工业生产废油的严重污染。面对这些海洋污染，人们习惯用化学方法进行简单处理，但是大多化学治理方法对环境易造成二次污染。大量研究认为，以微生物为主的生物修复法具有更高的生物降解能力和环境兼容性。从长期受油污染的海水中筛选出能够产生物表面活性剂的高效柴油降解菌是此类研究的关键[3]。本研究从浙江舟山渔场油污染严重的海水中分离筛选到一株柴油降解菌，现将相关研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

本研究海水样品取自浙江舟山油污染严重的定海码头和马峙渡口，分别标记为DH和MZ。取回的油污染严重的表层海水置于经灭菌处理的采样瓶中密封低温保存，带回实验室。

1.2 培养基制备

富集培养基：NaCl 24.0 g，MgSO4·7H2O 7.0 g，NH4NO31.0 g，KCl 0.70 g，KH2PO42.0 g，Na2HPO4·12H2O 3.0 g，微量元素液5 mL，经0.22 μm滤膜过滤的0#柴油2 mL，蒸馏水1 L，pH值7.4。

发酵培养基：(NH4)2SO410 g，KCl 1.1 g，NaCl 1.1 g，FeSO4·7H2O 0.28 mg，KH2PO43.4 g，K2HPO4·13H2O 4.4 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母膏0.5 g，微量元素液0.5 mL，经0.22 μm滤膜过滤的0#柴油2 mL，蒸馏水1 L，pH值7.4。

微量元素液：ZnSO4·7H2O 0.029 g，GaCl20.024 g，CuSO40.025 g，MnSO4·H2O 0.017 g，蒸馏水100 mL。

1.3 产生物表面活性剂柴油降解菌的筛选

1.3.1 柴油降解菌的分离和柴油降解率的测定

取10 mL海水样品加到装有100 mL富集培养基的锥形瓶中，28 ℃、200 r·min-1恒温摇床培养7 d，然后移取10 mL培养液转接到新的培养液中，如此转接培养4次后进行平板涂布，挑选不同的单菌落划线分离，编号，-20 ℃斜面保存。

将各单菌落分别接种于以柴油为唯一碳源的发酵培养液中，28 ℃、200 r·min-1培养7 d，然后用20 mL沸程为60～90的石油醚萃取发酵液中未降解的柴油，萃取液低温高速离心10 min，取20 μL离心液稀释10倍，用紫外分光光度法测定各单菌株的柴油降解率[4]。

1.3.2 排油圈直径的测定

在直径为90 mm的平皿中加入50 mL蒸馏水，然后将1 000 μL的液体石蜡缓缓加在蒸馏水表面，待其均匀铺开形成油膜，在油膜中心加20 μL离心除去菌体的细菌发酵液，待其推开油膜形成排油圈，测定排油圈直径[5]。

1.3.3 表面张力的测定

利用全自动表/界面张力仪测定发酵液的表面张力(空白样的表面张力为74 mN·m-1)，每个样品组测定3次取平均值[6]。

1.3.4 免疫溶血实验

将纯化的各单菌株点样接种于血平板上，28 ℃恒温培养24 h，观察单菌落周围有无透明的溶血圈，并比较溶血圈直径大小[7]。

1.4 菌种鉴定

通过形态学观察、生理生化实验和16s rRNA序列分析，对筛选得到的产表面活性剂的菌株进行菌种鉴定。首先将菌株接种于DifcoTMMatine Agra 2216培养基，28 ℃纯化培养1 d，提取基因组DNA，将DNA稀释至70 ng·μL-1用作PCR扩增模板，利用正向引物(5′-3′，AGAGTTTGATCCTG GCTCAG)和反向引物(5′-3′，GGTTACCTTGTTA CGACTT)进行扩增。扩增体系25 μL为模板DNA 0.5 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl24 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各1 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL。扩增结束后测序，测序结果利用细菌模式网站(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)和NCBI进行对比，找出同源性最高的已知菌种，从GenBank数据库中找出近源菌株的16s rRNA序列，与测定序列共同进行Clustal X程序校准多序列比较，再用MEGA6软件以邻接法构建系统发育树。

1.5 生物表面活性剂的鉴定及特性分析

1.5.1 表面活性剂的提取

发酵液在4 ℃、12 500 r·min-1条件下离心30 min去除菌体，用6 mol·L-1的HCl调上清液pH值至小于2.0，4 ℃过夜。然后将相同体积上清和氯仿-甲醇(V∶V为4∶1)溶液共同加到梨形分液漏斗中萃取沉淀，有机相减压蒸馏得到表面活性剂粗品，将粗品溶于0.5 mol·L-1的NaHCO3溶液中过滤，用6 mol·L-1的HCl调滤液pH值为2.0，4 ℃静置24 h，4 ℃、12 500 r·min-1再次离心15 min收集沉淀，真空冷冻干燥得成品。

1.5.2 薄层色谱

将表面活性剂纯品溶于甲醇溶液，点样于硅胶板，以氯仿-甲醇-水(V∶V为4∶3∶2)为流动相进行表面活性剂展层。然后在硅胶板上均匀喷洒酸性茚三酮溶液，110 ℃条件下显色10 min，脂质表面活性剂显红色斑点[8]。

1.5.3 傅里叶变换红外光谱

取1 mg表面活性剂纯品压片于4 000～400 cm-1光区进行红外光谱扫描。

1.5.4 气相质谱脂肪酸分析

取5 mg的表面活性剂纯品，用1 mL 6 mol·L-1的HCl溶液90 ℃水解24 h，然后加入5 mL的超纯水，用1 mL乙醚萃取3次，合并萃取相并吹干，加入1 mL体积分数为10%的硫酸甲醇溶液，55 ℃条件下酯化360 min。加入5 mL的超纯水，乙醚萃取3次，合并吹干，加入0.5 mL甲醇超声溶解，过滤，进行GC/MS分析。气相色谱条件：高纯度氦气(99.999%)，进样口温度250 ℃，流速1 mL·min-1，分流比10∶1，进样量1 μL。程序升温条件：起始温度120 ℃维持3 min，10 ℃·min-1升温至260 ℃，维持5 min。质谱条件：EI离子源温度230 ℃，电力电压70 eV，四极杆温度150 ℃[9]。

1.5.5 乳化性能和临界胶束浓度测定

取各菌株发酵液和液状石蜡各5 mL分别加入试管中，漩涡振荡2 min混匀，室温静置24 h后测量乳化层高度，乳化稳定值(E24)=乳化层高度/液体总高度×100[10]。

将表面活性剂纯品配成100%～0梯度浓度的溶液，用表面张力仪于室温下测定各浓度的表面张力，绘制浓度-表面张力曲线，确定临界胶束浓度。

2 结果与分析

2.1 降解菌的筛选

经过富集培养、测定各菌株的柴油降解率，初步筛选出7株柴油降解菌，依次标记为DHA、DHB、DHC、DHE、MZA、MZB、MZC(表1)，其中，菌株DHA对柴油的降解率最高，达82.7%，且免疫溶血为阳性(图1)，排油圈直径为6.0 cm，高于其他菌，发酵液体表面张力可从74 mN·m-1降至21.66 mN·m-1，明显低于其他菌株的表面张力。综合以上结果，判定菌株DHA产生了表面活性剂。

2.2 降解菌株的鉴定

DHA菌株的生理生化实验结果如下：革兰氏染色，阳性；MR反应，阴性；VP反应，阴性，蔗糖发酵，阳性；柠檬酸实验，阴性；明胶液化，阴性；吲哚实验，阴性；硫化氢实验，阴性。对菌株DHA的16s rRNA序列进行比对分析，选取同源性高的16s rRNA序列，利用MEGA 6软件进行统计分析，并将结果构建系统发育树(图2)，结合泊杰氏细菌鉴定手册，DHA被最终鉴定为不动杆菌(Acinetobacter)。

表1 柴油降解率、免疫溶血、排油圈、 表面张力实验结果

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

图1 DHA菌株的免疫溶血实验结果

图2 菌株DHA的系统发育树

2.3 表面活性剂的鉴定

2.4 表面活性剂的组成

通过GC/MS对脂肽脂肪酸进行结构组成分析，总离子色谱图如图5所示，质谱图如图6所示。图中质核比m/z=103的基峰为典型的β-羟基脂肪酸甲脂的特征峰，即[CH(OH)CH2COOCH3]+离子碎片。β-羟基脂肪酸甲脂离子峰失去(CH3OH+H2O)、H2O和H分别产生M-50、M-18、M-1的离子碎片峰，据此可得出，脂肪酸甲脂为C15β-羟基脂肪酸甲脂，所以菌株DHA产生的表面活性剂主要是由C15β-羟基脂肪酸构成的。

2.5 表面活性剂的特性

经测定和计算，菌株DHA产生的生物表面活性剂乳化效率高达64.7%，临界胶束浓度为52.2 mg·L-1(图7)。

图3 产物的薄层色谱

图4 产物的红外光谱扫描

图5 产物水解酯化后的总离子色谱

图6 脂肪酸甲脂的质谱

图7 表面活性剂表面张力曲线

3 小结与讨论

本研究从浙江省舟山渔场柴油污染的海水中筛选得到1株产脂肽类生物表面活性剂的高效柴油降解菌株DHA，经鉴定为不动杆菌(Acinetobacter)，其对柴油的降解率达82.7%，发酵产生的表面活性剂为脂肽，乳化效率为64.7%，临界胶束浓度为52.2 mg·L-1，主要由C15长链脂肪酸构成。

生物表面活性剂具有化学表面活性剂不具备的特殊性能，对疏水性有机化合物具有很好的乳化作用，因而能有效地提高环境中难降解有机污染物的生物降解速率；因此，产生物表面活性剂的微生物在生态环境修复中具有很好的应用潜力。产生物表面活性剂的微生物广泛存在于自然环境中，尤其是在有机污染物污染的环境中，比如炼油厂的地面土壤、废水和废油中[11]。从被原油污染的海水中分离筛选出产生物表面活性剂微生物的研究已有报道：Hassanshahian等[12]从波斯湾和里海被污染的海水中分离得到25株原油降解菌株，其中有11株可产生生物表面活性剂；Yateem等[13]从被柴油污染的土壤中筛选到1株可降解柴油的枯草芽孢杆菌，该菌株可产生脂肽类生物表面活性剂。本研究证明，舟山海洋生态系统中存在废油降解微生物，这些废油降解微生物可产生脂肽类生物表面活性剂，这为浙江近岸海域油污染海水的生物修复提供了生物材料与科学依据，对进一步治理海洋环境污染具有一定的参考价值和应用潜力。

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