巴迪亚寿的组织培养及育苗技术

茅汝佳，高 燕

(上海植物园 上海城市植物资源开发应用工程技术研究中心，上海 200231)

寿为百合科瓦苇属(Haworthia)多年生草本植物[1]，原产于南非。大多数寿叶片呈莲座状紧密排列，有线状脉纹[2]。巴迪亚寿(Haworthiamirabilisvar. badia)是近些年杂交出的新的园艺品种，属于硬叶类植株，叶缘有白色小刺，叶表面有白色条纹，呈现透明或半透明的窗[3]，松散总状花序，白色小花。由于其外形可爱、生长缓慢，备受园艺工作者和花卉爱好者的喜爱。

瓦苇属植物很多品种自交不亲和[4]。目前市面上的大多为分株繁殖和叶插繁殖，这类方法都存在繁殖速度慢、繁殖系数低、生长速度慢等问题，而采用组织培养的方法可以很好地解决。近些年，同属部分多肉品种组培获得成功，目前有康平寿[5]、截型十二卷[6]、克里克特寿[7]、冰沙糖寿[8]等多肉品种组织培养的相关报道。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2015—2016年在上海植物园科研中心实施。巴迪亚寿取自上海植物园多肉馆，如图1。在幼嫩花序抽长并且花蕾尚未展开时，截取整个花茎部位作为起始材料。

图1 巴迪亚寿幼嫩花序

1.2 方法

取巴迪亚寿幼嫩花序部位，去除闭合花蕾的外苞片，将花蕾连同花柄逐个分离，放置玻璃瓶中，纱布封口。花序部位先用洗洁精溶液浸泡30 min，后在流水下冲洗2 h。准备酒精灯、75%乙醇、2%次氯酸钠溶液、0.1%升汞溶液。提前灭菌以下材料：玻璃瓶装ddH2O、封口100 mL三角瓶、纱布、镊子、手术刀、滤纸。

1.2.1 灭菌

以下工作均在超净工作台中完成：外植体放置于无菌三角瓶中，用无菌水冲洗2次后，75%乙醇振荡清洗30 s，再用无菌水冲洗2次。随后用2%次氯酸钠溶液和0.1%升汞溶液两种消毒液对外植体消毒，再用无菌水冲洗6次后，滤纸吸干水分，放置于培养基上。消毒液和消毒时间的差异对外植体诱导有不同的影响，根据诱导阶段出芽的差异确定最佳消毒办法。

1.2.2 诱导培养

利用MS为基本诱导培养基，添加不同浓度的激素。激素采用细胞分裂素6-BA和生长素NAA形成不同组合，6-BA的浓度范围为0～2 mg·L-1，NAA的浓度范围为0～0.2 mg·L-1。根据诱导结果确定最佳诱导培养基组合。

1.2.3 增殖培养

利用MS为基本培养基，添加不同激素，配置增殖培养基。激素采用细胞分裂素6-BA和生长素NAA形成不同组合，6-BA的浓度范围为0～2 mg·L-1，NAA的浓度范围为0～0.04 mg·L-1。根据增殖阶段植物的生长状态和增殖率确定最佳增殖培养基。

1.2.4 生根培养

以1/2MS为基本培养基，添加不同浓度激素，激素分别采用IAA、IBA、NAA 3种，浓度范围为0～1 mg·L-1，配置成不同的生根培养基。根据苗生长状态、根生长状态、生根率和根长等确定最佳生根培养基。

1.2.5 驯化移植

组培生根后，在自然光照下培养1周，揭开瓶盖放置3 d。取出组培苗放置水盆中，清洗附着在苗上的培养基。将清洗过的组培苗放置阴干一周后，整理根并种植于穴盘中。

1.2.6 育苗培养

组培苗在驯化移植成功后，从穴盘转至营养钵中。基质仍然采用草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉为3∶1∶1∶2(V∶V)。室内温度保持20 ℃左右，湿度85%，每1个月浇水使用多菌灵溶液起到杀菌的功效。如有条件，可以每月施加薄肥一次。

2 结果与分析

2.1 灭菌方法的筛选

灭菌材料为寿幼嫩花序，每1.0～1.5 cm截取成一小段，分离单个未展开花蕾，去除苞片。在经过初步洗洁精和流水浸泡冲洗后，先用75%乙醇浸泡30 s，清水冲洗2次，再尝试2种灭菌液灭菌，分别为2%次氯酸钠溶液和0.1%升汞溶液。由于两种灭菌液的灭菌效率不同，对外植体的伤害也不同，选取适合的灭菌时间尤为重要。实验中，用2%次氯酸钠溶液分别对外植体灭菌6、12和18 min，用0.1%升汞溶液分别对外植体灭菌5、8和11 min，获得不同的污染率和出芽率。如表1所示，用2%次氯酸钠溶液灭菌12 min时，相比较同灭菌液的另外两个灭菌时间，出芽率最高为35%，此时对应的污染率为12.5%。当用2%次氯酸钠溶液灭菌18 min时，污染率比12 min的灭菌时间更低，仅为2.5%，但是由于灭菌液对外植体的灭菌时间过长，出芽率降低为7.5%。与之对应，采用0.1%升汞溶液作为灭菌液，灭菌8 min时，污染率为7.5%，此时的出芽率为75%，而灭菌时间达到11 min后，污染率为0，此时的出芽率降低为5%。综合比较，以高出芽率和正常出芽形态为目的，用0.1%升汞溶液灭菌8 min为最佳的灭菌方法，此时污染率为7.5%，而出芽率达到75%。

表1 不同灭菌液和灭菌时间对巴迪亚寿诱导 脱菌的影响

2.2 诱导阶段激素选择

以MS为基本培养基，添加6-BA和NAA两种激素。生长素和细胞分裂素是组织培养诱导阶段常使用的激素，适当的激素浓度配比可以促进组织诱导。

灭菌后的起始材料接种于诱导培养基上，培养基添加细胞分裂素6-BA和生长素NAA。如表2所示，6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1时，诱导率最高为66.7%。此时，15 d左右可以出芽，生长速度较快且芽体发育正常。不添加激素的基本培养基上未能诱导出芽，最后起始材料呈灰褐色。只添加了NAA的情况下，诱导情况不理想，仅在NAA 0.1 mg·L-1时，有少量芽出现，诱导率仅为6.7%，且芽生长极为缓慢。当6-BA 1 mg·L-1时，少量细弱的芽出现，且生长较慢。6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1时，15 d左右诱导出芽，在此情况下诱导出的芽生长较快且发育正常，此时诱导率为26.7%，基部有少量球形绿色愈伤形成。6-BA 2 mg·L-1时，芽的诱导率仅为13.3%，同时有少量绿色愈伤组织。当6-BA 2 mg·L-1，而NAA的含量升高达到 0.2 mg·L-1时，芽开始出现畸形的现象，芽体变形，芽膨大，玻璃化明显，基部有愈伤。

表2 不同激素含量对寿诱导的影响

由此可以看出，6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1是最适合芽诱导的培养基组合，此时芽诱导率66.7%，没有形成愈伤组织。

2.3 增殖阶段激素选择

经过诱导培养基接近1个月的培养，将诱导的芽转至增殖培养基。如果芽基部有愈伤，拨除干净再转至培养基。

表3看出，不同激素浓度对巴迪亚寿的芽增殖有不同的影响。当不含6-BA时，增殖率较低，最高的只有1.85倍，苗伸长倍率最高也仅为1.39倍，整体来说略有生长，但是生长较弱。当6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1时，芽的伸长倍率为2.65倍，对应的增殖倍率达到最大，为4.62倍，叶片生长明显，形成大量新芽。当6-BA为2 mg·L-1时，芽的伸长和增殖倍率都略有下降，叶片细长，部分出现基部愈伤的现象。特别当6-BA和NAA浓度较高的时候，芽膨大变形成为绿色半透明的畸形苗，出现玻璃化现象。图2看出，在增殖培养基(6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1)上培养25 d，芽生长健壮，没有畸形和玻璃化的情况。

表3 不同激素含量对巴迪亚寿芽增殖的影响

2.4 生根培养

将增殖的芽分成单株取出转接于生根培养基。基本培养基为1/2MS，添加IAA、IBA、NAA 3种激素，观察壮苗结果和生根情况。

根据表4可以看出，3种不同激素对植株影响有较大差异。完全不添加激素的情况下，仅1/2MS培养基使植株略有生长，但非常有限，植株整体基本没有粗壮，没有形成根。添加IBA后，苗上部分生长正常(图3)，但是无法形成或者仅少量形成根，IBA 0.5 mg·L-1时，根的长度为0.5～1.0 cm。添加 NAA后，植株下端形成愈伤，且无法形成根。添加IAA 0.5 mg·L-1的情况下，植株粗壮，形态正常，部分生长良好可以看到窗，且形成粗壮根，根平均数量6～10根，长度2～7 cm。

表4 不同激素含量对巴迪亚寿壮苗和生根的影响

注：起始材料为茎段。

图2 寿增殖培养25 d的植株

图3 生根培养1个月后形成根

2.5 驯化移植

组培苗形成完整植株后，可以转至穴盘炼苗。穴盘中装入的基质为草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉为3∶1∶1∶2(V∶V)。种植组培苗于穴盘后，少量浇水，上方安置遮光网，放置于大棚内，温度20 ℃，湿度85%左右(图4)。生长2个月，寿成活率可达98%。从土中挖出根，可以看到根相比较前期伸长明显，且部分形成新根。

图4 驯化移植3个月后的巴迪亚寿

2.6 育苗技术培养

巴迪亚寿喜欢凉爽通风的半阴环境。在自然状态下培养时，一般春、秋两季养护较易，而高温的夏季或者低于0 ℃的冬季，巴迪亚寿处于半休眠至休眠状态，生长缓慢或停止。养护时，要注意通风、凉爽和干燥，可选择适当遮阴，避免烈日暴晒和长期雨淋。巴迪亚寿喜欢空气湿度略高的环境，但不可频繁浇水或积水，防涝防浸泡。初期的小苗可以用带盖的育苗盘种植，用以保持空气中的水分。但是夏季高温时需要去除育苗盘的盖子，防止植物因闷湿而死亡。

巴迪亚寿对光照较敏感。植株的生长于光照有直接关系。光照过强会导致叶片灼伤，而光照太弱会导致植株生长散漫不紧凑，并且“窗”透明度差。恰当的光照才能让巴迪亚寿有完美的株型和明亮的“窗”。

3 小结与讨论

植物组织培养是植物快速繁殖最有效的办法，相比较叶插、播种等方法有很多优势，例如繁殖速度快，繁殖系数大；繁殖后代整齐，遗传性状得以保持；可获得脱毒苗等。植物组织培养需要选用适合的外植体，外植体可以从新生侧芽、叶片、花序和种子等方面选择。但因为新芽发生部位在根部接近土壤处，难灭菌，叶片分生能力较差，后期分化也比较弱；种子为杂交产物，母体的优良性状难以保持，因此细胞分裂旺盛的花序是很好的起始材料[9]。花序经过灭菌后可以作为诱导材料。次氯酸钠利用分解的氯气杀菌，毒性较小。升汞是一种剧毒物质，利用其重金属汞离子破坏微生物蛋白质的方法杀菌。在本实验中，利用0.1%升汞振荡灭菌8 min是比较适合的灭菌方法，污染率为7.5%，出芽率为75%。升汞灭菌后，需要用灭菌水多次振荡冲洗，本实验中冲洗6次，尽可能漂洗升汞残留物，减少升汞对外植体的伤害。

将灭菌的寿接种至诱导培养基，诱导培养基添加了6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1，此组合可以获得较高的诱导率，同时诱导出的芽体发育正常，没有出现膨大或者玻璃化，可以保证后续过程中芽的正常发育。

分离芽体转至适宜的增殖培养基。增殖培养基添加6-BA 1 mg·L-1和NAA 0.02 mg·L-1，可以保证芽体正常发育，没有出现膨大或者玻璃化，另外也保证了巴迪亚寿的增殖率和伸长率。在此培养条件下，伸长率为2.65倍，增殖率为4.62倍，植株正常发育。

实验后期的生根过程中，分别添加3种激素对比后，发现1/2MS附加激素IAA 0.5 mg·L-1，组培苗生长健壮，发育正常，没有畸形和愈伤发生，并且可以形成粗壮根，每株平均6～10根，长度2～7 cm。另外，每瓶种植少量苗可以促进植株发育。实验中每瓶种植1～2棵明显比种植4～6棵的粗壮。组培壮苗的过程可以促进巴迪亚寿快速生长，打破自然状态下寿长势缓慢的特点。

常规多肉繁殖方法有分株繁殖、叶插繁殖和播种繁殖。分株和叶插两种繁殖方法有很多相似的地方，例如取得健康植株上部或者肉质叶后，放置在干燥的地方，涂抹多菌灵，防止伤口腐烂。在伤口晾干后，直接扦插入土，保持土壤湿润可以促进基部生根、植株成活。本实验中尝试生根苗种植和未生根苗瓶外生根两种方法。实验过程中为防止植物长菌，可以用稀释的多菌灵浸泡10 min再晾干。未生根苗的生根方法与叶插法一致。在随后两个月的观察中发现，未生根苗的根可以在土中生长出，但是生长速度较慢，且根相比较已生根苗细软。半年后观察两种苗，生根苗长势旺盛，而未生根苗相比弱很多。因此，组培中生根的步骤值得保留。

驯化成功后，将生长健壮的苗从营养钵中转至盆中生长，但是夏季高温的时候不适合巴迪亚寿的转移。转苗时，盆底放置5～6粒奥绿缓释肥(意大利撒得盼化学公司Sadepan Chimicas.r.l)，再添加基质草炭∶火山石∶鹿沼土∶赤玉为3∶1∶1∶2(V∶V)。通透性较好的基质有助于根的健康生长。转盆初期不加其他肥料，防止植物不耐受。转盆两个月后，每月喷施氮、磷、钾有效养分各为20%的通用型花多多水溶速效肥，稀释浓度为1%。生长期浇水掌握不干不浇，浇则浇透的原则，避免积水，更不能淋雨，尤其不能长期淋雨，以避免烂根，但也不宜长期干旱，否则叶片干瘪，叶色黯淡[10]。

[1] 宋晓涛，沈萌，左志宇，等.十二卷属植物西山寿的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2007,43(5):883-884.

[2] 王燕，牟豪杰，吕永平，等.寿锦的离体植株再生及组培产业化增殖[J].植物学报，2017,52(3):331-336.

[3] 高越, 王娅欣, 孙涛, 等. 毛玉露的组织培养与快速繁殖[J].生物学通报，2010,45(6)：54-55.

[4] 陆文佳.浅谈多肉软叶十二的杂交繁殖[J].花卉，2016(11)：34-35.

[5] 孙涛，金蕊，李德森. 康平寿的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学报，2003,39(3)：232.

[6] 孙涛，李德森. 截型十二卷的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学报，2002,38(6)：586.

[7] 左志宇，李建希，安晓云，等.克里克特寿的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学报，2007,43(2)311-312.

[8] 牟豪杰，王燕，吕永平，等.冰沙糖寿组培快繁研究[J].安徽农业科学，2016,44(32)：140-141,157.

[9] 郭生虎, 朱永兴，关雅静.百合科十二卷属玉露的组培快繁关键技术研究[J].中国农学通报，2016,32(34)：85-89.

[10] 兑宝峰.玉露的栽培繁殖[J].中国花卉园艺，2009, 3(6): 34-35.