II型糖尿病合并阿尔兹海默症小鼠模型的实验研究

陈智玲, 吴 华, 宋鑫磊

(1. 合肥市滨湖医院急诊药房, 合肥 230000; 2. 浙江省舟山市外洋螺医院, 舟山 316000)

糖尿病是一类由于胰岛素分泌绝对不足和/或相对不足导致的，以慢性血糖水平增高为临床特征的代谢紊乱性疾病，其中Ⅱ型糖尿病(T2D)约占糖尿病总数的90%以上[1]。阿尔兹海默症(AD)是以大脑认知、识别和记忆功能障碍, 伴随性格及行为改变为临床特征的一类中枢神经系统退行性疾病，是临床上导致痴呆的主要原因[2]。近年来的流行病学研究表明[3]，T2D和AD均有衰老、肥胖、久坐、高血脂、胰岛素抵抗等共同的危险因素。同时,T2D患者其罹患AD的风险约为正常人群的2倍。药理学研究也表明，很多传统降糖药物对于AD均有治疗效果[4]。以上证据均间接表明两种疾病间存在显著的相关性，但对于两者间的相互作用机制至今尚未阐明。本实验选取了两种疾病的经典动物模型，AD小鼠(APP/PS1)和T2D小鼠(db/db)，试图通过杂交的方式，获得两种疾病并存的动物模型，为研究两者间的相互作用机制和临床药物评价提供模型支持。

1 材料与方法

1.1 动物来源及试验条件

SPF级雄性AD模型小鼠APP/PS1 (APPswe/PS1dE9), 10周龄, 体质量17～21 g, 购于南京君科生物工程有限公司[SCXK(苏)2016-0003]。 SPF级雌性T2D模型小鼠db/db, 10周龄, 体质量35～39 g,购于上海邦耀生物科技有限公司[SCXK(沪)2016-0008]。试验动物均饲养于安徽医科大学实验动物中心[SYXK(皖)2017-006]。本试验所涉及的杂交及相关动物操作均获得安徽医科大学动物伦理委员会的批准。

1.2 杂交法制备混合动物模型、基因型鉴定、分组

第一次选取雄性AD小鼠(APP/PS1+/+/db/db+/+)和雌性(APP/PS1-/-/db/db+/-)进行杂交，选取子代中基因型为(APP/PS1+/-/db/db+/-)的雌雄小鼠交配，根据孟德尔遗传定律，最终获得9种不同基因型的子代小鼠。小鼠出生后10 d，利用剪趾法获取组织，通过裂解法提取其DNA[6]，使用PCR对DNA进行扩增，再使用电泳法确定小鼠是否含有APP、PS1和db基因，从而确定其基因型。表1列举了PCR中使用的APP、PS1、db引物序列(上海捷瑞生物工程有限公司)。

表 1 PCR中APP、PS1、DB引物序列Table 1 Sequence of APP, PS1 and DB primers in PCR

按照基因型检测所得结果，选取基因型为(APP/PS1+/+/db/db-/-)的小鼠, 即为T2D合并AD模型小鼠, 随机抽取30只, 分入模型组(M组); 选取基因型为(APP/PS1-/-/db/db+/+)和(APP/PS1-/-/db/db+/+)的正常小鼠, 随机抽取30只, 分入对照组(C组)。M组和C组按照小鼠的年龄再随机分为4周龄、14周龄和25周龄3个亚组，每组10只，用于后续实验。

1.3 模型动物代谢指标的测定

对4周龄、14周龄和25周龄小鼠，采用尾静脉取血，使用生化分析仪(BS-200 深圳迈瑞)，分别测量小鼠空腹血糖、餐后血糖含量; 使用ELISA试剂盒(德国罗氏公司)，按照其使用说明书测定小鼠血胰岛素含量和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR); 使用体质量秤(上海衡诺)测量各组小鼠体质量。

1.4 Morris水迷宫实验

小鼠在不同时间点分别进行Morris水迷宫实验(宫体: 分为4个象限, D=120 cm, H=40 cm, 安徽正华生物仪器有限公司; 自动监测分析软件: Ethovision XT, 荷兰)。首先进行定位航行实验，连续5d，第1日不放置平台, 小鼠水中游泳适应2 min。然后设置平台, 将其固定在第2象限水面以下1.5 cm处。其后4d, 每日固定时间段训练4次, 每次2 min。将小鼠随机面对迷宫墙壁放入水中，记录其游泳路径和逃避潜伏期，如果没有找到平台，则将时间记为120 s。每日训练成绩为当日训练潜伏期的平均值。第6日，拆除平台，开始空间探索实验。所有小鼠从第1象限同一入水点进入迷宫，记录其120 s内在第2象限内游泳时间占总时间的比率。

1.5 脑组织切片的制作

水迷宫实验结束后, 在每组小鼠中随机抽取5只,立即以水合氯醛麻醉，并迅速开胸，将针头固定于主动脉, 剪破右心耳，首先使用生理盐水150 mL(含质量分数0.37%硫化钠)灌注冲洗。接着取出脑组织，使用质量分数4%多聚甲醛固定4 h，放入蔗糖溶液(质量分数30%, 4℃)中直至脑组织沉底。

1.6 焦油紫染色

冰冻脑组织，选择距离前囟点分别为1.5 mm,0.5 mm, -0.5 mm, -1.5 mm，-2.5 mm和-3.5 mm的6个部位制备30 μm脑组织切片。使用焦油紫对切片进行染色，于光学显微镜(Olympus, 德国)下观察，并使用Image J 软件进行图像数据采集，从而获得不同时间点(4、14、25周龄)和部位(皮质区、海马区)的脑组织的解剖数据。

1.7 免疫组织化学染色

取脑组织切片，体积分数70%甲酸预处理后，加入鼠抗-Iba1单抗(Wako，日本) (1∶2 000)和兔抗鼠Aβ单抗(6E10)(4G8, Covance, Greenfield,IN, USA)(1∶2 000)抗体，4 ℃下孵育, 再加入二抗山羊抗鼠594(绿色)和羊抗兔488(红色)(Molecular Probes, 美国) (1∶500)。使用免疫荧光显微镜(Molecular Machines & Industries AG, 瑞士)观察, 分析皮层和海马中Aβ蛋白的含量及位置分布。同时观察小胶质细胞的数量及大小。利用类似的方法，使用anti-GFAP(DAKO, 1∶3 000)染色，同样观察星形胶质细胞的分布情况。

1.8 tau蛋白和磷酸化tau蛋白水平测定

每组剩余5只小鼠, 在水迷宫实验结束后, 迅速断头取脑, 置液氮中冻存。取5～10 mg脑组织, 加入50 μL裂解液、蛋白酶(Cell Signaling, 美国)和磷酸酶抑制剂(Sigma, 美国), 制作组织匀浆。4 ℃下离心5 min, 取上清液。用考马斯亮蓝法(Biorad, 德国)[7]进行上清液中蛋白定量。蛋白质在10%丙烯酰胺丙烯酰胺凝胶上进行分离。接着将电泳结果转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Schleicher& Schuell, Keene,NH)上。膜浸入缓冲液(Invitrogen, 美国)中, 加入抗tau蛋白抗体 (1∶1 000) (DAKO, 丹麦)、抗磷酸tau蛋白抗体(1∶1 000) (clone AT8, Fisher Scientific,MA, 美国), 在4℃下孵育过夜。接着加入一抗兔抗鼠(Invitrogen, 美国), 使用β-actin(1∶2500 000)(Sigma, 美国)作为参考。最后，使用Image J软件进行光密度半定量测量。

1.9 统计学方法

运用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验和单因素方差分析, 组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠不同时间点的各项代谢指标

从表2可知，无论是体质量、血糖还是胰岛素含量方面, 同龄的M组均显著高于C组(P＜0.01)，25周龄组均显著高于其他年龄组(P＜0.01); 而14周龄组也显著高于4周龄组(P＜0.01)。同时，25周龄时，M组小鼠出现胰岛素抵抗。提示模型小鼠表现出典型的T2D的代谢特征，且随着年龄的增长，表现的更加显著。

2.2 两组小鼠不同时间点的认知记忆功能

从表3可知，C组在各个年龄段的对应天数，其搜索平台潜伏期均显著小于M组(P＜0.01); M组在4和14周龄，随着训练天数的增加，搜索平台潜伏期越来越低, 且各组间均有显著的差异(P＜0.01);而在25周龄时，只有第1日的潜伏期显著长于其后的3 d(P＜0.01)，而后3 d间则无显著的统计学差异(P＞0.05)。提示模型小鼠在各个年龄段的学习能力均显著低于正常小鼠；这种现象在25周龄表现更加突出。

表 2 两组小鼠不同时间点各项代谢指标Table 2 Metabolic indices at different time points in two groups of mice

表 3 两组小鼠不同时间点Morris水迷宫搜索平台潜伏期Table 3 Latency of Morris water maze search platform at different time points in two groups of mice s

表 4 两组小鼠在Morris水迷宫中原平台象限时间比率Table 4 Time to head ratio in the primary quadrant of the Morris water maze in the two groups of mice %

2.3 两组小鼠不同时间点脑组织解剖学特征

从表5可知，M组各年龄段大脑重量均显著低于C组(P＜0.01); 但大脑皮质面积和海马面积，均为14周龄后, 显著低于C组(P＜0.01)。M组在4周龄时，大脑重量和皮质面积均显著大于其他年龄组(P＜0.01); 14周龄组，皮质面积仍显著大于25周龄组(P＜0.01)。海马面积方面，25周龄组则显著小于其他各组(P＜0.01)。提示M组相较于C组在14周龄后，发生了显著的脑萎缩。M组脑重量降低主要发生在4～14周龄的早期; 而皮质面积的降低则随年龄增长，持续显著降低; 海马面积降低则主要发生于14～25周龄的晚期。

表 5 两组小鼠不同时间点大脑解剖指标Table 5 The brain anatomical indexes of two groups of mice at different time points

2.4 小胶质细胞、星形胶质细胞免疫组织化学染色

从图1～3可知，模型小鼠25周龄时出现SP，SP周围小胶质细胞和星形胶质细胞体积均显著增大。随着年龄的增长，小胶质细胞数量明显增多；且在25周龄时，无SP沉积的脑实质中，小胶质细胞和星形胶质细胞的数量均显著增加。提示随着年龄的增长，脑内炎症反应增强。

2.5 不同组小鼠不同年龄脑皮质和海马中tau蛋白磷酸化状况

从图4和表6可知，模型组在14周龄后，无论是皮质区还是海马区，磷酸化tau/总tau的比值均显著高于对照组(P＜0.01)。模型组随着年龄的增长，皮质和海马区磷酸化tau/总tau的比值显著增加(P＜0.01)。在相同的年龄时，皮质区这一比值也显著高于海马区(P＜0.01)。提示14周龄后，模型组脑内tau蛋白磷酸化现象不断增强，且这一现象在皮质区较海马区更剧烈。

图 1 不同时间点小胶质细胞和SP免疫组织化学染色图Figure 1 Immunohistochemical staining of microglia and SP at different time points

图 2 不同时间点星形胶质细胞和SP免疫组织化学染色图Figure 2 Immunohistochemical staining of astrocytes and SP at different time points

图 3 模型小鼠25周龄时皮质区和海马区SP免疫荧光染色(标尺=125 μm)Figure 3 SP immunofluorescence staining (=125 μm) in cortex and hippocampus in group M at the age of 16 weeks

图 4 不同组小鼠不同年龄皮质中tau蛋白电泳Figure 4 Tau protein electrophoresis in different age groups in different groups of mice

表 6 不同组小鼠不同年龄脑皮质和海马中磷酸化tau/总tauTable 6 Phosphorylated tau/ total tau in different age groups, cerebral cortex and hippocampus in mice of different groups

3 讨论

为了研究T2D和AD间的相关性，建立两种疾病并存的动物模型是实验研究的基础。理想的动物模型应尽可能模拟人类疾病的发病过程、病理变化及临床表现; 且具有高度的可复制性和可靠性，同时模型易于建立、性价比高。

目前已有多种类型的T2D和AD的动物模型。按照建模的方式，大体可以分为自发型、实验诱导型和转基因型三大类。其中实验诱导型[9]主要是通过物理、化学、生物等多种手段对动物造成损伤，以模拟人类疾病的病理过程和临床症状。其中此类型的T2D模型[10]主要是通过手术切除或是化学药物通过损毁胰腺组织来建模，建模简单, 经济易得, 成功率较高; 但模型稳定性较差，难以模拟胰岛素抵抗现象。而此类型的AD[11]模型，则是通过电损伤基底核、海马注射Aβ或是皮下注射D-半乳糖、AlCl3等手段来构建，但模型稳定性较差，药量和损毁程度较难掌握，且只能部分模拟AD的病理变化。自发型动物模型是动物在自然状态下因发生基因突变而罹患遗传病，且该病的病理过程或临床表现可模拟人类疾病。此类型的T2D[10]模型遗传背景清晰、遗传稳定性高，同时可以很好模拟T2D的高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等症状及多种并发症。因此，是目前公认的进行糖尿病研究的经典动物模型[8]。但此类T2D[10]模型也存在纯合子不育，饲养条件要求高，无酮症酸中毒表现等不足之处。而此类型的AD[11]模型则是近交系快速衰老小鼠，其较为理想地复制了AD的发病过程及病理、临床特征，但寿命较短且价格昂贵。近年来，随着高通量测序技术的进步和生物信息学全基因组关联分析的发展，大大提高了人们对于复杂疾病遗传病因的探索力度。T2D与迟发性阿尔兹海默症(LOAD)作为多基因和环境因素共同作用形成的复杂疾病，目前发现了众多的“危险基因”，但它们不能直接导致LOAD的发生，只是其多态性可以影响个体对于LOAD的易感性。因此较难通过转基因技术制作LOAD动物模型。但对于早发性阿尔兹海默症(EOAD)，研究则显示了较为明确的致病基因，主要是APP、PSEN1和PSEN2三个基因以常染色体显性的方式遗传，并取得了实验验证。通过对这些基因的敲除，获得了目前常用的经典AD动物模型APP/PS1小鼠。

为了获得同时患有T2D和AD两种疾病的混合模型，学者做了多种不同的尝试。有学者[12]利用Pdx1+/-小鼠和APP/PS1小鼠杂交，从而获得两种疾病合并的模型。但该模型较正常小鼠体质量发生了减轻, 虽然有高血糖表现, 但胰岛素抵抗较弱, 不能很好模拟糖尿病的临床表现。还有学者[13]利用Sorcs1-/-小鼠和APP/PSEN1小鼠进行杂交, 获得模型小鼠具有性别差异，雌性小鼠较为符合合并模型的要求，降低了模型的普适性。本实验选择了T2D和AD两种疾病的经典动物模型(db/db小鼠和APP/PS1小鼠)，通过杂交的方式获得基因型为(APP/PS1/db/db)(+/-/-/-)的合并模型小鼠。通过与正常小鼠的对比分析表明, 模型组小鼠从4周龄开始即表现出了高体质量、高血糖、高胰岛素血症及胰岛素抵抗等T2D的典型临床表现。同时出现大脑重量降低, 学习、记忆功能减退; 14周龄时, 出现脑皮质和海马面积降低，tau蛋白磷酸化; 25周龄时, 出现Aβ沉积，并形成SP, 同时小胶质细胞和星形胶质细胞增多等典型的AD病理表现即临床症状。同时, 这些病理过程及临床症状均随着年龄的增长不断加重，能较好的模拟人类的病情发展过程。但本模型也存在模型小鼠无生育繁殖能力; 无法模拟神经纤维缠结; 人类T2D较少发生瘦素基因突变; 无法模拟LOAD等缺点。这些均有待对于T2D和AD两种疾病病因机制和基因突变的进一步研究。

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