坑道噪声性听力损失易感者血清差异表达蛋白的筛选及鉴定△

段富家 张延平 李丽娜 蒋兴旺 刘金伟 肖林

噪声性听力损失(noise-induced hearing loss, NIHL)是人们在长期接受噪声刺激后而发生的渐进性感音神经性听力损失。坑道工事不管是在和平年代还是战争时期的战略地位都极其重要，由于坑道处于密闭环境中，施工时设备运转都会产生较大的噪声，而且坑道对于噪声吸收差，使其形成了持续性、来回反射的混合性噪声，长期暴露于此环境中，可造成渐进性听力损失。研究发现NIHL的发生存在个体易感性，遗传因素可能使某些个体对噪声的易感性更高[1]，目前NIHL易感的机制还不完全清楚，尚未见到有关血清分子标志物报道。

蛋白组学研究方法已经广泛用于疾病特异性标记物的筛选工作，可以避免单个基因、多个基因简单叠加产生的敏感度、特异度矛盾，对临床诊断和疾病预后判断具有重要的价值。本研究在前期研究[2]基础上，通过双向电泳及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spetrometry，MALDI-TOF-MS)对坑道作业官兵NIHL易感个体和非易感个体血清差异表达蛋白进行分离和鉴定，为进一步研究坑道作业官兵NIHL易感性发生原因、筛选易感个体的血清分子标志物提供实验依据。

1 资料与方法

1.1材料与仪器 冷冻离心机(北京离心机厂)、IPGhor等电聚焦仪(美国GE Healthcare)、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪(美国GE Healthcare)、ImageScanner扫描仪(美国GE Healthcare)、ABI 5800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪(德国Bruker公司)、真空冷冻干燥机(德国Christ公司)、血清高丰度蛋白去除试剂盒(美国Merck公司)、PDquest分析软件(美国Bio-Rad公司)等。

1.2研究对象 前期研究[2]在某两个施工坑道作业工龄1年以上的官兵中随机抽取296名士兵，均为男性，年龄18～39岁,平均24.20±7.56岁，用Madsen ITERA(丹麦，尔听美)听力计按GB7583-1987检测官兵脱离噪声作业16～24小时后左、右耳0.125～8 kHz纯音气导听阈，按照《工作场所物理因素测量噪声》(GBZ/T 1 89.8—2007)规定的抽样方法进行抽样，使用个人声暴露计(AWA一5610E型，杭州爱华仪器设备有限公司生产)测量坑道作业时不同工种的个体噪声暴露强度和时间，并按等能量原理计算每个人的累积噪声暴露量(cumulative noiseexposure,CNE)；根据上述结果,使用线性函数模型建立噪声暴露与听力损失之间的线性关系，分析自变量CNE(X)与因变量预测平均高频听阈(Y) (3 000、4 000、6 000 Hz三个频率纯音气导听阈均值)之间的关系；根据296名官兵实测的平均高频听阈与线性模型中的预测听阈值绘制了人群易感分布图，根据NIHL易感人群分布,将这296名士兵分为易感组和非易感组。本研究从上述易感组和非易感组中各选取20例作为研究对象，其中，易感组平均年龄24.79±2.03岁，高频平均听阈48.55±11.54 dB HL，语频平均听阈22.43±8.31 dB HL；非易感组平均年龄23.67±3.56岁，高频平均听阈9.40±2.54 dB HL，语频平均听阈13.40±4.13 dB HL，两组年龄差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试对象均签署知情同意书，实验方案经解放军第309医院医学伦理委员会批准。

1.3血清样品处理 每例研究对象抽取空腹静脉血5毫升，进行双向电泳研究。新鲜的血清样品立即去除高丰度蛋白，转移至超滤管中,4 000×g离心1 h进行除盐浓缩，得到血清样品,分装,置- 80 ℃ 冰箱保存备用,用BCA 法测血清样品浓度。

1.4双向凝胶电泳 先进行第一向等电点聚焦，取-20 ℃冷冻保存的 IPG预制胶条(17 cm,pH4～7),室温中放置10 min。沿着聚焦盘中槽的边缘线性加入样品,分清胶条的正负极,将IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上,在每根胶条上覆盖2 ～ 3 ml 矿物油,对好正、负极,盖上盖子,设置等电聚焦程序。然后进行第二项SDS-PAGE电泳，等点聚焦完毕,将IPG 胶条转移至水化盘中,加入胶条平衡缓冲液Ⅰ (6 mol/L尿素,2% SDS,0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl,20%甘油,0.02 g/ml DTT),在水平摇床上缓慢摇晃15 min,吸掉平衡缓冲液I,再加入胶条平衡缓冲液II(6 mol/L 尿素,2% SDS,0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl,20% 甘油,0.025 g/ml碘乙酰胺),摇晃15 min；配置10%丙烯酰胺凝胶,电泳参数:40 V/gel 30 min,150 V/gel 4 h,直至溴酚蓝线达胶底线。电泳结束后，银染着色；凝胶图像分析用扫描仪获取图片,用PDquest 8.0对2 组凝胶图像分别进行背景消减,剪裁,匹配生成一致的凝胶图像,2组间差异蛋白采用t检验进行分析,以变化倍数大于2.0倍或小于0.5倍且t检验满足P<0.05为标准选择差异蛋白点用于质谱分析[3]。

1.5蛋白质质谱鉴定 将需鉴定的差异蛋白点从胶图上切下,经脱色、酶解等步骤后进行MALDI-TOF-MS 分析。将一级和二级质谱数据整合并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot 2.1(Matrix Science)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定；搜索参数如下：数据库为NCBInr；检索物种为：human；酶为Trypsin；允许最大漏切位点为1；固定修饰为Carbamidomethyl(C)；可变修饰为Oxidation(M)和Acetyl (N-term)；MS tolerance 为100 ppm, MS/MS tolerance为：0.3Da.Protein score CI%大于95为鉴定成功。

1.6统计学方法 采用STATA 12.0统计软件处理，符合正态分布的定量资料用均数±标准差描述，两组间比较采用t检验。所有的统计检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清蛋白双向电泳图谱分析结果 通过PDquest分析软件对易感组和非易感组2-DE电泳图谱进行自动检测和匹配对分析，共检获蛋白斑点1 120个，经蛋白斑点的匹配和对比分析，可以发现两组间蛋白表达图谱明显不同，主要表现为蛋白斑点灰度值的差异。易感组和非易感组差异表达(增高2倍或降低小于0.5倍且P<0.05)的蛋白斑点总数为37个(图1),绝大多数集中于pH5～9 的偏酸性区域,相对分子量介于14.4～66.2 ku(图2)。易感组这37个差异蛋白斑点灰度值均值为13 804.27±14 510.62，非易感组为79 820.32±139 333.2，易感组灰度值低于非易感组，差异有统计学意义(t=-2.758，P=0.009 1)。

图1 坑道噪声易感组与非易感组血清蛋白双向电泳图谱 a～c为易感组三次电泳结果,d～f为非易感组三次电泳结果

图2 两组坑道噪声个体血清蛋白双向电泳图谱差异表达标注图 a为易感组,b为非易感组

2.2差异蛋白斑点的质谱鉴定结果 对37个差异表达蛋白点进行质谱分析鉴定，获得28个蛋白斑点的肽指纹图谱(图3)。采用Mascot软件与NCBI数据库中已知蛋白的标准肽指纹图谱相比较,获得各蛋白斑点的鉴定结果，其中易感组表达量比非易感组增加2倍以上的蛋白斑点22个，经质谱鉴定得到16个多肽；易感组比非易感组表达量减少0.5以上的蛋白斑点共15个，经质谱鉴定获得12个多肽。排除高丰度蛋白，相同多肽选择得匹配分值(mowse score)分大于66者，如：相同多肽匹配分值均大于66选择得分高者，共获得10个差异表达多肽(表1)，其中蛋白酶体亚基α-5、补体C4A、结合珠蛋白、载脂蛋白A-I和玻璃体结合蛋白在易感个体表达上调，而溶菌酶C、β-2糖蛋白- 1、色素上皮衍生因子、胰蛋白酶抑制剂重链H和甲状腺素运载蛋白表达下调，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图3 差异蛋白斑点肽质量指纹图谱 经4700型质谱仪鉴定,以其中含量最高的多肽(1437.6)峰值强度13019为100%

3 讨论

为了从分子水平探讨NIHL的预防方法，目前研究者主要是对基因与NIHL易感性的关系进行探讨，其中单核苷酸检测是筛选易感基因的主要方法[4]。由于研究对象的种族不同、研究方法不同、样本量大小不同以及研究对象的职业不同、接触的噪声不同，不同的研究结果不完全一致，这也从一个方面反映了NIHL易感基因具有弱效性、异样性或重叠效应，增加了易感基因研究的难度。

差异蛋白质组学研究重在找出有意义的差异蛋白，可以同时发现多个疾病特异性标记物，避免了用单一基因或数个基因的简单叠加检测产生的敏感度和特异性的矛盾，对疾病诊断标志物的筛选和诊断标准的制定具有重要意义。双向电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是蛋白质组学研究中分离蛋白质样品的关键技术，能够在一块凝胶上分离出上万个蛋白质且所得蛋白质组分纯度>90%。在前期研究[2]基础上，本研究利用2-DE加MODI-TOF-MS技术对我军某部坑道作业官兵噪声性听力损失易感个体和非易感个体各20例血清进行双向电泳研究，结果发现易感组差异表达蛋白质斑点灰度值较非易感组低(P<0.05)，进一步对差异表达的蛋白质斑点进行MALDL-TOF-MS和生物信息学分析鉴定,结合肽指纹图谱在NCBI数据库中准确匹配鉴定出差异表达的10种蛋白质，这10种蛋白中，蛋白酶体表达上调最明显。蛋白酶体(proteasome)广泛分布于真核细胞细胞质和细胞核中，与泛素一起构成主要降解细胞内蛋白的泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome path, UPP)；蛋白酶体是由1个20S核心蛋白酶体和2个19S调控组成，20S蛋白酶体由α环和β环组成圆筒状结构，β环是蛋白酶体的活性位点，是水解反应发生的场所，而α环通过阻止蛋白进入水解空间控制底物与β环的接触，从而调控β环的活性，因此α环对于蛋白酶体的功能发挥起重要作用。研究表明UPP存在于细胞代谢各个方面，此途径调节异常或活性下降与许多疾病发生密切相关[5]。

表1 10个差异表达蛋白质电泳图谱分析鉴定结果

注：数据库源自NCBI BLAST，评分大于66为蛋白质匹配评价有显著性意义(P<0.05)

蛋白酶体抑制剂可以抑制蛋白酶体活性，影响细胞的生长、分化和死亡过程，目前硼酸肽类蛋白酶抑制剂bortezomib已经应用于临床肿瘤治疗中，成为治疗多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤的强效化疗药物[6]。最近发现有些患者使用蛋白酶体抑制剂后出现了感音神经性聋，Lee等[7]对该副作用发生的原因进行了进一步的研究，发现bortezomib可以抑制PST1(perxisome signal transmission)信号途径，导致自由基在细胞内大量聚集，最终可能与耳蜗毛细胞损伤和听力下降有关，进一步证实了蛋白酶体参与氧化应激反应过程。UPP的一个重要生理功能就是参与细胞氧化应激过程的调节，有研究发现在过氧化氢处理后，视网膜色素上皮细胞系ARPE.19细胞内蛋白酶体的表达明显增加，表达部位主要位于细胞核内和核膜周围，这种细胞核内蛋白酶体的过表达可能对保护细胞核免受氧化应激的损伤有重要的作用[8]。以上研究说明UPP可以通过选择性降解错误折叠或受损的蛋白质，应对不同环境的应激所引起的细胞内异常。

目前研究认为强噪声引起的氧化应激是导致NIHL发生的主要原因，强噪声可能引起大量自由基产生、诱导内质网应激性凋亡导致耳蜗组织损伤[9，10]。本研究结果显示坑道噪声易感个体与非易感者相比，血清中蛋白酶体α5亚单位表达显著增加，提示其可能与NIHL的易感性有关，推测该蛋白可能通过以下途径参与了NIHL的发生：①NIHL易感个体在坑道内长期慢性噪声刺激作用下，可能更容易引起耳蜗内氧化应激反应，产生大量的过氧化氢等有害物质，细胞内代偿机制引起蛋白酶体合成增加以应对环境的变化，保护细胞核等重要结构免受损伤；②在坑道噪声的刺激下，蛋白酶体α5亚单位合成增加，使圆筒结构两端封闭更加严密，导致泛素化底物无法与β环的催化酶接触，激活内质网应激凋亡途径导致细胞凋亡，或通过抑制过氧化物酶表达下降，使噪声导致的氧化应激反应产生的自由基清除受阻，引起自由基堆积，通过损伤细胞DNA、使脂质过氧化等反应导致细胞凋亡或死亡。但这些推测还需要进一步的实验证实。

此外，据报道，甲状腺素运载蛋白(transthyretin，TTR)、补体C4A、β-2糖蛋白-1(β-2GPI)、人类色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)、胰蛋白酶抑制剂五种蛋白与耳聋相关。TTR基因突变是导致常染色体显性遗传性系统性淀粉样变性的主要原因，提示TTR与耳蜗的结构和功能可能存在密切的关系[11]；本研究发现NIHL易感个体外周静脉血中TTR蛋白表达比非易感个体明显下调，说明该基因与坑道NIHL易感性发生可能存在一定相关性。C4A等补体片段又被称为过敏毒素，可以引起很强的炎症反应[12]，Harada[13]发现过敏毒素可导致豚鼠耳蜗血管纹囊性变、Reissner's膜塌陷、血管纹萎缩、迷路积水和耳蜗神经变性，说明过敏毒素可以导致耳蜗出现病理改变，这些改变与人类一些内耳疾病的病理变化相同，提示包括过敏毒素在内的炎性介质与内耳疾病发生密切相关；本研究结果显示NIHL易感个体血清中补体C4A表达明显升高，提示炎症反应在坑道噪声NIHL易感性发生中可能也起一定的作用。双向电泳研究结果显示梅尼埃病患者血清中β2-GPI表达下调，提示β-2GPI与其他蛋白有可能成为梅尼埃病早期诊断的分子标记物[14]；此外，研究者发现抗β-2GPI抗体可能与突发性聋患者的急性期状况和预后有一定的相关性[15]；本研究结果显示β-2GPI在坑道NIHL易感个体血清中表达降低，提示β2-GPI与坑道作业个体NIHL易感性可能相关。Ziff等[16]发现PEDF可能是耳硬化症发病的共同致病基因，此外，PEDF在梅尼埃病患者血清中表达上调，提示PEDF与其他蛋白有可能成为梅尼埃病早期诊断的分子标记物[14]；从本研究结果看PEDF在坑道NIHL易感个体血清中表达降低，提示PEDF与坑道作业个体NIHL易感性可能相关。研究发现丝氨酸和金属蛋白家族蛋白酶抑制剂在分泌性中耳炎的发生中起重要作用，α1抗胰蛋白酶制剂直接注射入南美洲栗鼠听泡内对其内耳结构及功能均未造成明显影响，提示胰蛋白酶抑制剂作为分泌性中耳炎治疗药物安全性较高[17]；本研究发现胰蛋白酶抑制剂在坑道NIHL易感个体血清中表达降低，其与坑道作业个体NIHL易感性也可能相关。

蛋白酶体[8]、结合珠蛋白[18]、TTR[11]、ApoA-I[19]、β-2糖蛋白-1[20]、PEDF[21]、胰蛋白酶抑制剂[22]和补体C4A[23]均与氧化应激的发生和发展有关，其中蛋白酶体、结合珠蛋白、ApoA-I表达上调可能是NIHL易感个体产生了应对较强的氧化应激反应措施、试图维持内环境稳定的表现，补体C4在氧化应激时可能进一步被激活，产生大量的C4A加重了听觉系统的损伤[23]，而TTR可能是在氧化应激产生的炎症作用下出现表达下调，β-2糖蛋白-1和PEDF在NIHL易感个体中保护细胞免受氧化应激损伤的作用可能被过强的氧化应激反应削弱，从而导致这两种蛋白表达下调，胰蛋白酶抑制剂抑制炎症反应的作用也可能被NIHL易感个体中的氧化应激反应所损坏引起表达下调。因此，上述蛋白表达的增加或减少，可能通过不同程度加重NIHL易感个体氧化应激反应，使自由基生成增多，促进NIHL的发生，从而可能成为坑道作业官兵NIHL易感个体血清特异性候选分子标志物。

综上所述，本研究结果为进一步研究坑道作业人员NIHL易感性发生原因提供了线索，也为探讨血清筛选NIHL易感个体的方法提供了参考。本研究的结果还需要使用ELISA等方法在坑道施工作业者中进行进一步验证。

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