耐冷嗜酸硫杆菌的生长特性和固定化培养

陈 鹏 王清良 胡鄂明 李 乾 刘天印 陈 宽

(1.南华大学核资源工程学院，湖南 衡阳 421001；2.核燃料循环技术与装备协同创新中心，湖南 衡阳 421001)

浸铀菌种多为中温菌，最适宜的生长温度为25～40 ℃[1-3]。因而，在新疆地区进行细菌浸铀就面临着巨大的挑战。李聪等[4]对新疆伊犁河谷地区近50 a来的气候研究表明：该地区春季平均气温为9.9 ℃，夏季平均气温为20.5 ℃，秋季平均气温为8.6 ℃，冬季平均气温为-7 ℃。另据现场观测，伊犁河谷地区某铀水冶车间吸附尾液温度在10～17 ℃，中温菌在此类尾液中会出现生长活性不高，氧化Fe2+速率慢等情况，严重时甚至出现细菌生长和繁殖停止等问题，以至于细菌浸铀技术未能在新疆酸法地浸采铀矿山推广应用。

针对上述问题，本试验采用耐冷嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillusferrivorans简称A.ferrivorans)作氧化剂，该菌具有好氧嗜酸特性，可在5～30 ℃生长繁殖[5-6]。M.Liljeqvist等[7]指出，A.ferrivorans是一种嗜酸菌，通过氧化Fe2+和硫化物获取能量，并从二氧化碳获得有机碳。A.Amouric等[8]对A.ferrivorans的运动性、鞭毛的有无、基因差异性等特征进行了详细研究。S.Christel等[9]利用RNA转录测序揭示了A.ferrivorans对无机硫化合物的氧化途径。C.González等[10]通过基因组分析了A.ferrivorans的遗传变异性，为细菌应用于生物冶金以及含硫废水的处理提供理论依据。Pinar Aytar等[11]从某矿山酸性废水中分离纯化了一株嗜酸硫杆菌，经16S rRNA基因测序和做系统发育树，得出该菌是一株A.ferrivorans，并且具有较强的脱硫效果以及氧化Fe2+能力。R.Ccorahua 等[12]从秘鲁某铜矿山酸性矿坑中分离纯化出一株A.ferrivorans，并研究了该菌浸矿的最适宜温度、pH以及生长动力学，表明该菌具有较好的应用前景。刘敏瑞等[13]采用16S rRNA 基因、RubisCO功能基因序列分析筛选来自新疆富蕴县的A.ferrivorans，表明A.ferrivorans与其栖息环境有一定的联系。余水静等[14]利用生物信息学方法鉴定和分析了一株A.ferrivorans的双组分信号转导系统(TCS)结构特征，表明A.ferrivorans具有嗜酸硫杆菌共有的TCS功能，如氮素固定及代谢调节、柠檬酸苹果酸代谢调节等，而特有的TCS功能涉及趋化性调控、重金属响应等。赵永红等[15]利用生物信息学方法挖掘出A.ferrivorans与其他嗜酸硫杆菌共49个抗砷基因，发现一些抗砷基因为嗜酸硫杆菌所共有，说明这类基因是嗜酸硫杆菌抗砷所必需的基因，有助于A.ferrivorans适应极端环境。莫晓兰等[16]通过对4株菌种在高氟环境下进行驯化，选育出了一株具有较高耐氟能力的菌种，运用16S rRNA基因克隆文库技术分析表明：该菌与A.ferrivorans菌相似度达到99%，并且具有较强的抗氟性和嗜铁性，A.ferrivorans菌将在含氟铀矿石的生物浸出中发挥重要作用。

目前，国内外虽有对A.ferrivorans性能研究的相关报道，但多集中于该菌耐受机理的理论研究，而A.ferrivorans菌作为酸法地浸铀矿山氧化剂的研究却鲜有报道。试验参照新疆某酸法地浸采铀矿山吸附尾液温度、pH以及生产工艺条件，初步研究了A.ferrivorans菌氧化Fe2+的特性，并在现场进行细菌的耐酸驯化，首次采用耐酸性强、比表面积大、直径为3～5 mm的生物陶粒作为浸铀细菌挂膜载体，对细菌进行固定化培养，提高单位体积的细菌数量，从而加快细菌连续氧化Fe2+速率，为A.ferrivorans菌代替中温菌在低温和高酸环境下作氧化剂提供依据。

1 试验材料及仪器

A.ferrivorans和A.ferrooxidans均来自于南华大学铀矿冶生物技术实验室，9K培养基试剂和FeSO4·7H2O购自天津市科密欧化学试剂有限公司，吸附尾液取自新疆中核天山铀业有限公司某厂水冶车间，耐酸生物陶粒购自荥阳绿锦活性炭有限公司，IS-RDD3台式恒温振荡器购自美国精骐有限公司，有机玻璃生物反应器(图1)为自制。

图1 生物反应器

2 试验方法

2.1 细菌氧化Fe2+的活性表征

A.ferrivorans和A.ferrooxidans在生长和繁殖过程中，作为电子传递链上的各种细胞色素都具有特定的氧化还原电位，随着Fe3+浓度的升高，培养液的氧化性随之增强，并且细菌以氧化Fe2+成Fe3+作为主要代谢途径，即细菌氧化Fe2+的速率与细菌的生长速率存在正相关关系[17]。所以细菌的活性通过测定培养液的氧化还原电位以及Fe2+的氧化速率来表征。

2.2 分析方法

试验用重铬酸钾滴定法测定培养液的Fe2+浓度，分析步骤及方法参见文献[16]；用pH计(pHS-3C)测定培养液的pH、氧化还原电位(简称Eh)。

2.3 培养基成分与菌种活化

试验所用9K培养基成分见表1，用2 mol/L硫酸溶液调节pH,另据条件试验Fe2+浓度要求添加 FeSO4·7H2O。为保证菌种活性，每次条件试验前，需对菌种进行活化培养。取2个250 mL锥形瓶，分别加入90 mL Fe2+浓度为1 g/L的9K培养基(pH=2.0)以及10 mL的A.ferrivorans或A.ferrooxidans(即按10%的体积分数接种)，测定初始Eh，置于恒温振荡器中，调节温度为25 ℃、转速为170 r/min，培养至Eh为500 mV左右即可作为接种菌种用于条件试验。

表1 9K培养基成分

2.4 接种量对A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影响

取6个250 mL锥形瓶，按5%、10%、20%、30%、40%、50%接种比例分别加入A.ferrivorans菌液7.5 mL、15 mL、30 mL、45 mL、60 mL、75 mL，再依次加入Fe2+浓度为1 g/L的9K培养基(pH=2.0)142.5 mL、135 mL、120 mL、105 mL、90 mL、75 mL。测定初始Eh及Fe2+浓度，置于恒温振荡器中，调节温度为25 ℃、转速为170 r/min，开始培养，每隔6 h测定Eh及Fe2+浓度，直至Fe2+氧化完全。

2.5 初始Fe2+浓度对A.ferrivorans生长活性的影响

取3个250 mL锥形瓶，分别加入初始Fe2+浓度为0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L的9K培养基(pH=2.0)135 mL以及15 mL的A.ferrivorans菌液，测定初始Eh及Fe2+浓度，置于恒温振荡器中，调节温度为25 ℃、转速为170 r/min，开始培养，每隔6 h测定Eh及Fe2+浓度，直至Fe2+被全部氧化。

2.6 温度对A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影响

取2个250 mL锥形瓶，分别加入135 mL Fe2+浓度为1 g/L的培养基(pH=2.0)以及15 mLA.ferrivorans或A.ferrooxidans菌液。测定初始Eh及Fe2+浓度，置于恒温振荡器中，调节温度为5 ℃、转速为170 r/min，开始培养，每隔24 h测定Eh及Fe2+浓度，其他温度条件(15、25 ℃)按相同方法依次进行。

2.7 A.ferrivorans的耐酸驯化

量取300 mL吸附尾液(成分见表2)至锥形瓶中，加入4.5 g浓硫酸和1.5 g FeSO4·7H2O，搅拌至溶解,再加入300 mL的A.ferrivorans菌液。测定初始Eh、pH，置于水浴恒温振荡器中，调节温度为25 ℃、转速为160 r/min，开始培养，每隔12 h测定Eh、pH。当培养液Eh达到550 mV左右时，量取此培养液300 mL作为接种菌液，按上述方法进行第二、三、四、五次耐酸驯化。

表2 吸附尾液成分

2.8 A.ferrivorans固定化培养

向装有5 L生物陶粒的反应器中加入2 L Fe2+浓度为1 g/L、pH=2.0的9K培养基，再加入0.4 L的A.ferrivorans菌液，测定初始Eh，调节通气量为 5 L/min，开始培养，每隔1 h测定培养液Eh和Fe2+浓度；待Fe2+氧化完成时，向反应器中加10 g FeSO4·7H2O，当Fe2+被完全氧化后，再补加1次 10 g FeSO4·7H2O；为验证细菌固定化效果，在保证反应器中生物陶粒不发生位置移动的前提下，排尽反应器中培养液后，不添加菌液，只加2 L Fe2+浓度为1 g/L、 pH=2.0的9K培养基，测定初始Eh，再调节通气量为5 L/min，培养至Fe2+全部氧化完成，按此方法重复8次。

细菌固定化完成后，取少量生物陶粒，加入浓度为4%的戊二醛固定处理，放入温度为4 ℃的冰箱内保存，用于扫描电镜分析。

2.9 固定化细菌与游离细菌氧化Fe2+速率的对比

细菌固定化培养结束后，放出反应器中的培养液，将此培养液均分成2份备用。放出反应器中的一半陶粒，再加入1份备用培养液，记为A培养液；另1份培养液加入未装填生物陶粒的反应器中，记为B培养液，再向A、B培养液中分别加5 g FeSO4·7H2O，测定初始培养液的Eh，均在通气量为5 L/min下培养，每隔1 h测定Eh和Fe2+浓度，进一步验证细菌在生物陶粒上的固定化效果。

3 试验结果与讨论

3.1 接种量对A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影响

细菌接种量直接影响培养液中的细菌基数，从而影响细菌的整体增殖速度和氧化Fe2+的速率。接种量对A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影响见图2。

从图2(a)可知，培养液初始电位随着细菌接种量的增加而增大，不同培养液中的细菌都在30 h左右开始进入对数生长期，表明接种量对细菌迟缓期的影响较小。从图2(b)可知，接种量从5%提高至50%，Fe2+浓度下降的速率越来越快，表明培养液氧化Fe2+的速率加快，Fe2+的氧化时间缩短。从代谢产物对细菌活性的影响[18]以及生产成本考虑，A.ferrivorans的接种量以10%为宜。

3.2 Fe2+初始浓度对A.ferrivorans生长活性的影响

对于A.ferrivorans来说，可利用Fe2+氧化成Fe3+过程中产生的能量来维持自身的生长繁殖。Kevin等[6]的研究表明，A.ferrivorans与A.ferrooxidans的DNA染色体的G+C只有4%不同，因此，A.ferrivorans可能类似于A.ferrooxidans，在产能过程中也需要Fe2+将电子传递给分子氧，传递过程中细胞质内有质子消耗，从而驱动ATP的合成来维持细菌的活性[19-20]。图3为Fe2+初始浓度对A.ferrivorans生长活性的影响结果。

图2 接种量对A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影响

从图3可知，氧化还原电位上升的幅度大致相当，且Fe2+的氧化速率也大致相当，这表明Fe2+的初始浓度对A.ferrivorans生长活性的影响较小，细菌完全可以在Fe2+含量为0.3～0.5 g/L的吸附尾液中较好地生长和繁殖。

图3 不同初始Fe2+浓度对A.ferrivorans生长活性的影响

3.3 温度对A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影响

温度对A.ferrivorans与A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影响见图4。

图4 温度对A.ferrivorans与A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影响

从图4可知，温度在5～25 ℃时，2种细菌氧化Fe2+速率都随着温度的升高而加快，A.ferrivorans尤为明显，说明随着温度的升高，细菌的细胞质膜流动性随之变大，这有利于营养物质进入胞内和代谢产物排出胞外，使细菌的生长繁殖加快，促使细菌氧化速率增加。在试验温度条件下，A.ferrivorans培养液中Eh上升的速度和Fe2+的氧化速率均高于A.ferrooxidans培养液。当温度为5 ℃，可能是由于A.ferrooxidans的细胞膜呈晶格排列，营养物质的运输受阻，酶促反应停止，导致细菌几乎处于停止生长状态，而A.ferrivorans能继续生长并保持较好的氧化性，主要是因为该菌自身具有耐冷基因以及脂肪酸合成中的特有基因族利于在低温环境中生长[21-22]，从文献[14]也可以推测，A.ferrivorans特有的TCS功能涉及耐冷调控。A.ferrivorans与A.ferrooxidans在生长繁殖过程中所发生的一系列化学反应绝大多数都是在特定酶催化作用下完成的，每一种酶都有合适的酶促反应温度，温度的变化影响酶促反应率，进而影响菌体的活性，结合新疆酸法地浸铀矿山所处的气候条件，A.ferrivorans更适于用作浸铀的目标菌种。

3.4 A.ferrivorans的耐酸驯化

在细菌生长和繁殖过程中，机体内发生的化学反应大多是酶促反应，而酶促反应必须在一定的pH范围内进行，在此范围内只要条件适合，酶促反应率达到最高，细菌生长活性最好，所以培养液的酸碱度是影响细菌生长活性的重要因素之一。细菌耐酸驯化试验结果见图5，图中1～5代表驯化次数。

图5 A.ferrivorans耐酸驯化试验

从图5(a)可知，A.ferrivorans第1次耐酸驯化时，细菌缓慢生长期较长，约为96 h；随着驯化次数增加，缓慢生长期缩短，对数生长期提前，细菌耐受酸的能力明显增强。表明A.ferrivorans在酸度较高的培养液中形成越来越完善的代谢调节机制，使细胞内复杂的生物化学反应能高度有序进行。从图5(b)可知，当培养液pH=0.31时，A.ferrivorans仍能保持较好的生长活性和氧化性，这也表明，A.ferrivorans经耐酸驯化后，完全适应酸法地浸采铀矿山吸附尾液环境。

3.5 A.ferrivorans固定化培养

在自然界中，细菌往往并不是以游离态存在和生长繁殖，而是会成群吸附到固体表面，共同分泌以多糖、蛋白质和DNA为主要成分的黏液到细胞外，形成多层有序的群体结构——能把自己包裹起来的生物膜。生物膜上分布有许多微小孔道，有利于营养物质进入膜内、代谢产物排出膜外，维持整个生物膜内细菌群体的生长和繁殖[23]。在适宜的生长环境下，A.ferrivorans菌也有形成生物膜的特点。

A.ferrivorans固定化培养试验在室内进行，反应器内培养液温度为19～20 ℃，试验结果见图6、图7，图6中的1～10代表固定化培养次数。

图6 A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化培养

从图6可知，对细菌进行第2次固定化培养时，Fe2+的氧化速率约为第1次的2倍，这是由于在第1次固定化培养后，在不更换培养基的情况下，直接补加2次FeSO4·7H2O进行静态培养，在此期间，可能生物膜在陶粒表面已初步形成，从而加快了氧化速率。为验证细菌是否形成生物膜，从第2次开始，只添加培养基未添加菌液，随着培养液更换次数的增加，反应器内细菌氧化等量Fe2+的速率也逐步增大，至第8次开始稳定在3 h左右。表明陶粒表面生物膜逐渐生成，膜内细菌的生长和繁殖随之加快，并且从第8次起，细菌在生物膜内生长和繁殖开始趋于稳定，氧化Fe2+的速率稳定在0.33 g/(Lh)左右。

图7 生物陶粒表面挂膜前后SEM图像

从图7(a)可知，生物陶粒表面比较粗糙，分布着不规则的纹理状结构和发育良好的孔隙，这为A.ferrivorans的附着提供了充足的场所，对比图7(a)，从图7(b)可以看出，生物陶粒表面形成了较厚且不均匀的生物膜，生物膜上可见利于细菌代谢产物排出和营养物质进入的微孔[24-25]，这些微孔也为细菌进出生物膜提供了通道。

3.6 固定化细菌与游离态细菌氧化Fe2+活性对比

通过固定化细菌与游离态细菌氧化速率对比试验，进一步验证A.ferrivorans生物膜形成后氧化Fe2+的效果，结果见图8。

从图8可知，A培养液中Eh上升的速度和细菌氧化速率明显高于B培养液,表明固定化细菌和游离态细菌协同氧化Fe2+的速率高于游离态细菌单独氧化的速率，即A.ferrivorans在生物陶粒上进行固定化培养有利于加快Fe2+的氧化速率，有助于解决以往细菌浸铀过程中Fe2+氧化速率较慢的问题。

4 结 论

(1)接种量对A.ferrivorans的缓慢生长期影响较小，考虑时间和经济成本，A.ferrivorans的接种量宜为10%左右；Fe2+的初始浓度为0.3～0.5 g/L时，对细菌的生长活性影响较小，表明吸附尾液中Fe2+含量为0.3～0.5 g/L能满足A.ferrivorans较快生长繁殖。

图8 A.ferrivorans固定化培养后氧化Fe2+速率对比试验

(2)温度为5～25 ℃时，A.ferrooxidans的最大氧化速率为0.018 g/(Lh)，A.ferrivorans为0.024 g/(Lh)，与A.ferrooxidans相比，A.ferrivorans更适应新疆酸法地浸铀矿山尾液的低温环境。

(3)A.ferrivorans经多次耐酸驯化，细菌能在高酸(pH=0.31)培养液中保持较好的生长活性，满足现场生产工艺要求。

(4)A.ferrivorans经过多次固定化培养，陶粒表面生物膜逐渐生成，氧化Fe2+速率持续加快，最大氧化速率达到0.33 g/(Lh)，固定化细菌和游离态细菌协同氧化等量Fe2+的速率是游离态细菌单独氧化的3.4倍，A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化，大幅提高了氧化Fe2+的速率。

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