畜禽疫病防控用SPF猪的开发

高彩霞, 辛 畅, 陈洪岩

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 哈尔滨, 150069)

中国是世界公认的养猪大国，但养猪产业中的疫病问题十分严峻，大力开展疫病防控研究是解决问题的出路之一。然而我国对畜禽疫病防控专用实验动物的研究却严重滞后, 净化、繁育等标准化技术体系匮乏, 已成为制约畜禽疫病防控的关键问题[1]。无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)猪是国际公认的标准化高等级农用实验动物, 是生命科学研究、生物制品生产的重要实验材料和原材料, 而且在畜牧兽医生产实践中发挥着重要作用[2], 它对于解决在动物疫病发生、发展、传播和致病机制研究以及防疫用生物制品研制中的科学问题和关键技术, 保证畜禽养殖业健康、可持续发展意义重大。

1 SPF猪在畜禽疫病防控研究中的重要性

动物疫病如今不再是一个简单的疾病问题，已演变成了一个国际政治、经济和社会问题，且日益严重，每年不仅给我国的畜牧养殖产业造成巨大的经济损失，而且一些人兽共患病直接威胁人类的生存和发展，严重影响我国的公共卫生和社会安全工作，需要高度重视其防控工作，增强疫病防控的科学研究，因此针对重大畜禽疫病的防控研究也就对实验动物提出了特殊需求，需大力开发畜禽疫病防控用模式动物[3]。SPF猪作为一种很好的模式动物，在畜禽疫病防控研究中发挥着不可替代的作用，它作为重要的支撑条件已成为生命科学、农业科学、畜牧兽医科学、医药科学等多领域必需的实验原料[4]。在畜牧兽医科学中，实验用猪大量应用于重大动物疫病致病机制、免疫机制及防控技术、疫苗的研制、胚胎移植技术、饲料营养成分等方面的研究，有效提高畜禽产品的质量及安全性，减少环境压力[5]。在生物医学领域，如新药试验、疾病诊断、疾病研究替代模型、器官移植等也都离不开SPF猪[6]。因此标准化的实验用SPF猪将对保障我国健康养猪业与疫病有效防控提供强有力的技术支撑。

2 国内外SPF猪的发展现状

2.1 国外SPF猪的发展现状

标准化实验用SPF猪的开发是农业、生命科学研究的基础和重要支撑条件之一。目前欧美多数国家已完成SPF猪的培育，具备成熟的繁育技术，形成完整的产业链。如美国、加拿大、英国、丹麦、瑞士、德国、法国、荷兰、原捷克斯洛伐克、南斯拉夫、澳大利亚、日本等国家和地区先后在政府支持下，建立了SPF猪审定协会或认定委员会，制定SPF猪认定标准，严格控制遗传学质量，建立了饲养净化猪群的整套生产体系和管理服务体系，对疫病的控制多达15种，涵盖了主要人兽共患病和重要传染病，具有完整的质量标准，全面的检测技术，并且建立了严格的模型构建及评价标准，动物获取及质量有保证。

2.2 国内SPF猪的发展现状

目前SPF猪已广泛应用于各个领域, 但我国对于标准化实验用猪的研究严重滞后, 科研、检定和生产使用实验用猪多从养殖企业中筛选, 但其种猪多来自国外, 祖代、曾祖代种猪场中种猪质量与国外尚有很大差距, 且由于我国实行强制免疫政策, 故难以获得畜禽疫病防控研究用实验猪(如口蹄疫、猪瘟等抗体阴性猪), 也有研究从农户散养猪中筛选, 不仅遗传背景杂乱, 携带的微生物、寄生虫背景不清，各种疫苗免疫或自然感染形成的抗体水平参差不齐, 导致动物实验重复性差, 结果离散度高[7]。目前大型模式动物小型化是一个发展趋势，我国小型猪品种和生产厂家较多，但标准和管理水平不同使得质量参差不齐，且主要用于医学研究及食用。尝试用于疫病感染模型制作，因其有天然疾病抗性，结果均一性较差。对于SPF猪的研究国内少之又少, 仅有北京市SPF猪育种管理中心、江苏省农业科学院和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位保有小规模的SPF猪群。哈尔滨兽医研究所于2014年从加拿大引进一批SPF大白猪和长白猪, 开始进行实验动物化培育, 目前, 猪群已净化了14种病原，生物学特性如生殖生理和血液生理生化方面基本稳定, 与其他实验用小型猪差异不大, 且遗传分化较小, 遗传结构稳定。此外还深入地分析了猪群白细胞抗原(SLA)分子特征和单倍型多样性, 发现不同的SLA-1分子体外提呈病原表位抗原肽的能力具有差异, 表明两种猪群作为实验动物初步用于疫病研究具有较好的效果, 因此具有较好的研究前景[8-13]。

3 SPF猪开发存在的问题

3.1 缺乏高质量种群，在畜禽疫病防控研究中利用

度较低，推广力度较差

在猪病、疫苗研究中多使用本动物，但因为我国目前尚无高质量的SPF种猪群，仅有个别单位保有小规模的SPF猪群，在畜禽疫病防控研究和生物制剂研发、生产等方面推广利用度较低。大多数畜禽疫病的研究如疫苗研发、临床试验、药物筛选、病毒感染主要采用来自农村的散养猪，降低了实验结果的可靠性，严重滞后了畜禽疫病防控的研究进程。

3.2 种群疫病净化难度较大，遗传背景杂乱

目前我国规模化猪场发展迅速，但也存在着相当大的风险。受猪场饲养环境、管理水平、疫病感染以及国家强制免疫政策等因素的影响，种群疫病难以净化，尤其是垂直传播疾病，而且受我国环境的影响，猪圆环病毒、猪细小病毒等很难做到彻底净化。目前如筛选猪圆环病毒阴性猪群常采用的方法: 大量集中采集猪外周血样品，同时检测病原和抗体双阴性的个体，将其隔离饲养，进而建群; 但是该病呈一过性发病，不易准确把握发病时间进行检测来淘汰阳性个体，不同的时间检测结果可能不同，因此很难彻底根除。随着剖宫产技术体系的建立，逐渐改用剖宫取胎、无菌接产和屏障或隔离环境饲养相结合，达到净化猪群垂直传播病原。哈尔滨兽医研究所已建立了成熟的剖宫产和无菌接生技术体系，对产前母猪和接生存活的仔猪进行病原检测时发现，母猪猪瘟、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、流行性乙型脑炎、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪细小病毒病等为阳性时，接生的存活仔猪全部为阴性，表明无菌接产法起到了较好的净化效果，有望建立猪圆环病毒、猪细小病毒等阴性猪群。但是该技术并不能保证百分百可以剔除垂直传播病原，且运行成本较高。随着生物技术的发展，应用胚胎移植技术培育SPF猪很大程度上弥补了传统方法的缺陷，而且利用胚胎移植技术净化的动物能避免病毒通过胎盘感染仔畜，但仍存在遗传背景不清晰、来源不清楚等问题，因此缺乏科学合理的净化方法和培育技术也制约了SPF猪种群建立[14]。建立遗传背景清晰的SPF猪种群，并有效地记录遗传信息，将会促进SPF猪实验动物化进程。

4 畜禽疫病防控用SPF猪种群的培育方法

常用的培育方法: 分析国内外畜禽疫病防控研究对SPF猪的使用情况，选取已经保有的基础种群或外引优良种群，采用经典遗传学、常规繁殖育种学选育个体，提出微生物、寄生虫学质量控制标准，通过多指标高密度病原、抗体检测淘汰阳性个体。对候选动物进行大规模筛查，加之体表清洁、药物驱虫、灭活疫苗免疫等综合净化技术，结合剖宫产和无菌接生技术剔除经雌性产道垂直传播病原等，获得SPF猪，饲养于屏障/隔离环境设施，采用建筑及内部正压方式进行物理隔离，进入设施的所有饲料、饮水、气流、物料经过灭菌、除菌处理，人员经过淋浴、更衣，阻断所有外界病原体再感染途径等综合措施，使获得的SPF猪得以保存和繁殖。控制遗传学质量，同时建立SPF猪病原净化、培育、繁殖、人工授精、剖宫产、人工饲喂、规模化生产、品种鉴定等关键技术，建立生产、饲养标准化技术体系, 建立核心群。同时定期检测和维护环境设施设备，采集生物学特性、表型和基因型大数据进行分析，实现共享利用。目前我国SPF猪育种管理中心、江苏省农业科学院和哈尔滨兽医研究所均已建立了成熟的剖宫产和无菌接生技术体系，可批量提供SPF猪; 重庆市畜牧科学院具有国内唯一的一个无菌猪培育技术平台，可以批量提供无菌猪。

此外，还可利用动物克隆技术、基因修饰和诱变技术、体细胞和生殖细胞冻存技术以及特定分子遗传标记基因(如SLA)筛选技术，开发一些特定的畜禽疫病防控研究用SPF猪种群。

5 SPF猪在畜禽疫病防控研究中的应用前景

目前, SPF猪在生命科学的各个领域研究中得到了广泛应用，是生命科学取得进步的主要研究平台之一, 在畜禽疫病防控研究中也有广泛应用前景。

5.1 用于畜禽疫病、人兽共患疫病防控研究

SPF猪对重大疫病的基础研究、应用研究以及生物医学研究有广泛应用前景[15]。如在兽医基础研究方面，实验用猪大量应用于动物重大疫病致病机制、免疫机制及防控技术研究，如猪瘟、高致病性蓝耳病、口蹄疫等重大疫病病原学、病原遗传变异与分子进化、诊断与监测技术以及新型疫苗研制等。哈尔滨兽医研究所保存的SPF大白猪和长白猪, 已净化了14种病原, 且遗传分化较小, 遗传结构稳定，可利用其优势研究影响培育的重要传染病病原的宿主关键分子，为改造特定SPF猪资源的培育提供修饰靶点，进而运用基因修饰技术建立抗病性较强的转基因实验用猪新品种。开发标准化实验用猪将对保障我国养猪业健康发展与疫病有效防控提供强有力的技术支撑，也可加快多种严重危害畜牧业的烈性病研究, 从而加强相关的疫病防控工作。

5.2 用于生物制品研发、生产和检验研究

兽医科学在动物疾病、人兽共患病研究中的作用是不言而喻的，生物制品在动物疫病防控过程中也是起着关键作用。开发畜禽疫病防控专用SPF猪既能提高传统疫苗产品的产量和质量，研制新型高效疫苗控制疫情, 发展兽用疫苗产业，加快产业创新, 也可满足兽医生物制品和人用疫苗研发、生产与检验中对大量标准化实验用猪的需求[16]。同时可用作高品质生物制品原料获取的主要来源，如提供合格的高品质SPF猪阴性血清，促进猪病相关的基础研究、检测方法的建立, 也是动物源性生物医用材料的主要来源，如角膜、包膜、胶原膜等。

5.3 用作人类医学研究的主要模型

在人类医学模型创制过程中，选择哪种实验动物作为靶动物是一个需要认真考虑的问题。从进化角度选择，非人灵长类动物与人的相似性可能更高，但是从实验动物的伦理和资源的获得上，使用非人灵长类动物会受到各种的限制[17]。猪在解剖学、生理学、疾病发生机制等方面与人相似，目前已被广泛运用于心血管病、糖尿病、皮肤烧伤、血液病等多方面研究，在生命科学研究领域中具有重要的应用价值，同时也在人用疫苗的研发和评价中发挥着不可替代的作用[18]。哈尔滨兽医研究所保存的SPF大白猪和长白猪，生物学特性如生殖生理和血液生理生化方面基本稳定，部分血液生理生化指标与人相似，可以作为人类医学研究的替代模型，如利用SPF猪遗传背景清晰且遗传结构稳定的优势研究如先天性红眼病、卟啉病、先天性小眼病、先天性淋巴水肿等遗传性疾病，可以提高研究结果的准确性和可靠性; 也可以用于构建心血管疾病的实验用动物模型，对研究心血管疾病形成的因素及治疗药物的开发具有较高价值。

5.4 用作异种器官移植的供体

由于猪在心血管系统、消化系统、皮肤系统等方面与人类具有较大的相似性，其心脏、肝脏、肾脏、胰岛以及神经细胞和软骨细胞，在结构和功能上与人几乎完全一致，可发挥原有器官的作用，因此是人类异种器官移植的重要来源[19]。将猪基因人源化改造后，能够批量生产出人类需要的细胞、组织、血液以及器官, 为人类开展异种器官移植和生物材料提供了充足的供体材料，是未来人类生命研究的一个重点发展方向，将为攻克人类重大疾病开辟道路。也有研究[20]利用巴马小型猪，建立了人肝癌异种移植模型，探索人肝癌细胞能否在猪的肝脏中存活，在肿瘤治疗和异种移植动物模型的建立研究中发挥着十分重要的作用。成年猪体大约携带有120多种病毒，任何一种影响人类的病毒随移植侵入, 都将导致不可预见的风险[21]。不仅异种移植受体本人有感染已知或未知病毒的风险，而且与受体密切接触者也有被感染的风险，因此“五星级”无指定病原体(DPF)猪的开发更为重要。此外，异种移植时，由于供体猪种属差异，受体对猪的器官会发生强烈的免疫排斥反应，主要包括超急性免疫排斥、急性血管性免疫排斥和急性细胞性免疫排斥。SLA是引起猪-人异种器官移植急性细胞性排斥的遗传因素之一。以不同SLA单倍型猪为供体进行异种器官移植后，移植效果存在明显差异。异种移植引起的CD8+T和CD4+T细胞免疫排斥反应的大小主要取决于供体细胞表面SLA I、II类分子与被CD8、CD4分子识别的HLA分子的同源性。猪-人异种移植时，供体SLA与受体HLA分子不可能完全匹配, 只能选择相似度较高的供受体组合进行器官移植，即移植前需进行严格的主要组织相容性复合体(MHC)配型，有利于减少免疫学因素的影响，延长受体和移植物的存活时间。因此, 明确不同猪品种的SLA单倍型特征对猪-人异种器官移植MHC配型的研究具有重要意义。目前已对哈尔滨兽医研究所保存的SPF大白猪和长白猪进行了SLA单倍型特征分析，发现了62个SLA等位基因，分别组成了17个I类和11个II类单倍型, 具有高度的多样性和潜在的器官移植价值[10,22]。此外还对我国多个地方品种进行了SLA单倍型多样性的研究，如: 巴马小型猪、五指山小型猪、融水小型猪和贵州小型猪等[22-26]。

标准化SPF猪群是生命科学研究的重要支撑条件之一, 更是畜禽疫病防控技术研发的核心支持。然而我国在该方面的研究却严重滞后, 制约了动物疫病防控产品的创制、防控措施的建立和防控效果的科学评价[27]。面向国家科技创新发展新态势和畜禽养殖业发展重大问题研究对实验动物资源的需求, 开发畜禽疫病防控用SPF猪已成为当前必须面对和加以解决的关键问题。我国在2017年国家重点研发计划重点专项“畜禽重大疫病防控与高效安全养殖技术研发”中设立了“畜禽疫病防控专用实验动物开发”项目, 表明我国已经将SPF猪的培育列入了重点研究范畴。