离子通道电流虚拟仿真实验在生理教学中的应用

杨 煜, 吕文伟, 吕若谷, 安 钢

(1. 吉林大学 基础医学院, 吉林 长春 130021；2. 吉林大学 公共卫生学院, 吉林 长春 130021)

离子通道是细胞膜上的一类特殊跨膜蛋白质构成的门样通道。这些蛋白质的中央形成的孔道有利于离子穿过,是无机离子进出细胞的重要物质载体,对维持细胞内离子浓度和配比平衡及机体代谢稳定起重要作用。离子运输具有选择性和开关性(可控制性)[1]。离子通道电流测量通常依靠昂贵的膜片钳-离子通道测量平台才能实现,而我校教学实验室不具备进行该实验的设备条件。为此,采用计算机仿真技术模拟实验操作环境,研制了离子通道电流虚拟仿真实验教学设备,在无膜片钳-离子通道测量平台设备的情况下开设了生理学测量离子单通道电流的教学实验,建立新型实验教学模式[2]。

1 离子通道电流虚拟仿真仪器特点

离子通道电流虚拟仿真实验仪器主要应用于生物电生理实验教学,可用于心脏、肝脏、神经、肌肉等多脏器的实验项目[3-9],对学生掌握抽象的离子通道蛋白的电生理特性及理解电生理理论起到促进作用。通过该实验,可以拓展对离子通道电流仪实验结果的分析和应用[10-12],培养学生在离子通道蛋白的电生理特性方面的科研能力。

生理教学的静息电位和动作电位以及神经调节等生理过程都是以离子通道蛋白分子的电生理特性为基础的。离子通道电流虚拟仿真实验仪器能够模拟膜片钳位实验操作环境,以较低的成本为本科生开设离子单通道电流仿真实验[13]。该仪器已申报国家专利(专利号:ZL 201420248873x)。

2 离子通道电流虚拟仿真仪器功能

离子通道电流仿真实验教学仪器的功能可分为封接实验、全细胞钳实验、膜片钳实验、全细胞钳实验数据分析和膜片钳实验数据分析等5部分。

(1) 封接实验。所谓封接就是使细胞与测量电极紧密接触。调节测量电极，使通过细胞孵育液的电流接近0,当测量电极通过细胞时检测的电流就是离子通道蛋白的电流。由于细胞的测量电极很小,很难通过感官判断封接的接触紧密程度；而通过仪器产生电压和电流,测量电极接收回路电流,就可测量封接电阻，从而监视接触紧密程度。封接电阻越大,则紧密接触程度则越高。当封接电阻值达到1 GΩ时便可进行实验。在实验过程中,封接操作是实验的难点。通过使用离子通道电流仿真实验教学设备的负压注射器,可以观察模拟封接过程的电阻变化。学生亲自动手进行封接实验,从而掌握电压钳技术、膜片钳技术和实验操作技能[14]。

(2) 全细胞钳实验。通过软件选单选择全细胞钳实验界面,输入最小钳制电压、最大钳制电压、钳制电压变化的间隔等实验操作的参数,然后用鼠标单击“开始实验”按钮,记录实验结果。学生直接观察到逼真的离子通道蛋白在不同的钳位电压下的电流随时间的变化曲线(见图1)。

图1 全细胞离子通道电流测试曲线

(3) 全细胞钳实验数据分析。在全细胞钳实验结束后,通过软件选单选项进入全细胞钳实验分析界面(见图2)。首先选择实验分析的时间段,然后用鼠标单击“电流电压曲线”按钮。针对不同钳位电压下的电流随时间的变化曲线进行分析和处理,从而可以得到电压-电流分析曲线,在电压-电流分析曲线上能直接看到细胞的某种离子通道蛋白的电压依赖特性。

图2 全细胞离子通道电流电压分析曲线

(4) 膜片钳实验。选择全细胞钳实验界面，输入采样频率、采样保持电压、采样屏数等实验操作参数,然后用鼠标单击“开始”按钮,记录和直接观察到单个离子通道在特定钳位电压下的电流随时间的变化曲线(见图3)。

图3 单离子通道电流开放和关闭测试曲线

(5) 膜片钳实验数据分析。在膜片钳实验结束后,选择膜片钳实验分析界面。输入实验分析相应的阈值参数,以便计算机自动识别通道的开放和关闭。单击开放时间统计按钮,将产生通道开放时间统计曲线；单击关闭时间统计按钮,将产生通道关闭时间统计曲线。对特定钳位电压下的电流随时间的变化曲线进行分析和处理,可以得到单离子通道蛋白开放和关闭特性的统计分析曲线,从而直观地看到细胞的某种离子通道蛋白的开关特性(见图4)。

图4 单离子通道电流开放时间统计曲线

3 实验操作

(1) 进行电极制备,用电极拉制器拉制几兆欧的电极,冲灌电极液。取蛙卵细胞并放入带有孵育液的平皿中待用。

(2) 将准备好的电极小心装入电极支架固定。在显微镜下找到平皿中的细胞,将电极对准细胞,在显微镜下继续小心放下电极,使电极与细胞接触。

(3) 小心、缓慢地抽吸连有电极的注射器,给细胞加负压,实现封接过程。

(4) 在封接过程中,由于注射器带动封接电位器滑动引起电阻的变化,通过封接电阻检测电路检测电阻的变化。

(5) 将检测电阻的变化通过A/D转换电路经过数字转化后输入中央控制器。

(6) 中央控制器通过微机通信接口电路将检测电阻的值输入微机,然后在软件系统控制下在微机屏幕上显示。一边加负压,一边观察,在微机的软件界面监控封接过程。如果封接电阻值达到1 GΩ,则表示封接成功。

(7) 封接成功后,进入实验记录过程。微机显示仿真实验的数据并且通过分析软件来完成仿真实验数据的分析。

4 结语

通过对离子通道电流虚拟仿真实验仪器的实验操作过程,学生能够观察到离子通道蛋白分子的电流记录曲线,较容易掌握离子通道的选择性。通过分析处理得到电压-电流分析曲线和通道关闭时间的统计曲线,较易理解离子通道的开放性,从而启发学生对离子通道蛋白的开-关特性和电压依赖特性的理解。结合仿真实验曲线分析脑部缺血、缺氧和再灌注损伤情况下的生理改变,能够更好地理解钠通道、钙通道细胞内外的跨膜离子浓度变化导致神经细胞急性渗透性肿胀的原因,为临床治疗急性缺血性脑卒中的药物选择提供理论依据。结合介绍有关离子通道的最前沿科研论文并组织课堂讨论[14-16],可以促进学生对生理学理论知识的应用,极大地提升了实验课的教学效果。

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