麦芽品种DNA指纹图谱构建的研究

张志军,岳 杰,尹 花,余俊红,董建军,周月南

(啤酒生物发酵工程国家重点实验室,青岛啤酒股份有限公司,山东青岛 266100)

啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料,经酵母发酵酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料,是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的,麦芽的质量直接决定啤酒的品质。不同麦芽品种彼此间酿造特性不同,如浸出率、糖化力、粘度等,酿造工艺必须根据麦芽品种的特点进行相应调整。因此麦芽品种鉴定是评价麦芽质量的重要指标,也是啤酒企业在商业麦芽采购中极为关注的评价指标。

目前大麦品种鉴定技术既有传统的形态鉴别方法、田间小区种植鉴定,也有蛋白质电泳鉴别方法和DNA分子标记法。田间小区种植鉴定被认为是鉴定品种真实性和测定品种纯度最为可靠、准确的方法,但该法鉴定周期长，气候、土壤等条件要求高[1]。Draper[2]认为大麦种子醇溶蛋白SDSPAGE电泳图谱可作为品种的生化“指纹”,用于大麦品种真实性和纯度的鉴定。林艳等[3]开发了啤酒大麦种子醇溶蛋白SDSPAGE电泳方法,利用GelPro软件对电泳图谱进行条带分析和比较,建立了每个品种的蛋白质“指纹”,组成加拿大啤酒大麦品种标准图谱库,但SDSPAGE法存在分辨率低、鉴定结果不够准确的问题[4]。游丽华等[5]利用蛋白质组学技术建立澳大利亚啤酒大麦醇溶蛋白标准图谱,成功鉴定出7个特异蛋白点和34个共同蛋白点,基于蛋白质点构成了3种澳大利亚啤酒大麦的蛋白标志物库。Scobie等[6]从大麦中提取储藏蛋白,利用MALDI-TOF质谱分析大麦蛋白质图谱,可对西澳种植的大麦品种进行快速鉴定。然而大麦经发芽、干燥后外观特征已发生变化,且醇溶蛋白在蛋白酶的作用下分解,因此麦芽品种鉴定已不适用于传统的大麦形态鉴别法和SDSPAGE蛋白质电泳鉴定法。浸出率、糖化力、库尔巴哈值等现有麦芽指标均是反映麦芽混合状态的平均值,无法体现麦芽到底是单品种构成还是多品种混合组成的具体特征。

随着DNA分子标记技术的开发和利用,DNA指纹图谱逐渐成为鉴定种子真实性的重要方法。DNA指纹图谱法主要依靠AFLP、RAPD、SSR和SNP等类型的DNA分子标记来构建不同品种的指纹图谱,然后利用具有多态性的标记进行种子真实性检测。Xue等[7]利用DNAAFLP技术对27种国产及进口大麦品种进行鉴定。Pattemore等[8]基于MALDI-TOF质谱分析从澳麦品种的45个遗传位点中选出33个信息位点得到唯一的SNPs条形码,可高效区分澳大利亚的35个啤麦和饲料大麦品种。麦芽中富含多糖、多酚、氨基酸等物质,与大麦相比麦芽DNA的分离纯化难度更大。更为关键的是麦芽经84～86 ℃高温焙焦2～3 h后DNA链容易断裂和降解[9],进而影响PCR的扩增效果。

简单序列重复(simple sequence repeat,SSR),又称微卫星,是一类由1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[10]。微卫星在植物基因组中非常丰富,同一类微卫星可分布于整个基因组的不同位置上。每个座位上重复单位的数目乃至重复单位的序列都有可能不同,因而造成了每个座位上的多态性,这种多态性的信息量是比较高的。由于每个微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列,因而可根据其两端的序列设计一对特异引物,通过PCR扩增获得简单序列重复的多态性。作为第二代分子标记技术,微卫星标记能更好的鉴定物种,已经广泛的应用在植物物种多样性和品种鉴定上,包括大麦[1116]、小麦[1720]等。谷方红等[9]从46对SSR引物中筛选到5个多态性较丰富的引物,可区分实验的8个大麦及麦芽品种。Lin[21]等利用SSR分子标记进行大麦品种鉴定,基于4对SSR引物建立17种大麦品种的等位基因检索系统。Southworth[22]基于毛细管电泳构建6对SSR荧光引物反应体系,可区分大多数已注册的英国大麦品种。Amani等[23]利用11个SSR标记对31个北非六棱大麦品种的遗传多样性进行分析。

本研究采用SSR分子标记技术,对21份进口及国产大麦麦芽品种的多样性进行研究,构建麦芽品种DNA指纹图谱数据库,为啤酒企业采购商业麦芽提供可靠的品种鉴定手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

21个啤酒大麦品种 包括5个加拿大大麦、9个澳大利亚大麦、3个法国大麦和4个国产大麦,品种名称及产地见表1,对上述大麦品种进行微制麦,得到相应的麦芽样品,微制麦条件,14 ℃浸麦44 h,15 ℃发芽4 d,45～70 ℃干燥5 h,84 ℃焙焦3 h,冷却后去根处理,4 ℃保存备用。植物DNA提取试剂盒 德国Qiagen公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs 美国Thermo Fisher公司;30%(w/v)丙烯酰胺溶液、5×TBE缓冲液、过硫酸铵、四甲基乙二胺、DNA Marker 生工生物工程(上海)股份有限公司;引物 由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 大麦品种名称列表Table 1 List of barley cultivars used

PCR仪、PAC3000型电泳仪 美国BioRad公司;离心机 德国Sigma公司;高通量组织研磨仪 北京托摩根公司;紫外分光光度计 美国GE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品DNA的提取 取单粒麦芽样品于2.0 mL离心管中,加入8 mm钢珠一颗,高通量组织研磨仪1200 r/min粉碎1 min,利用Qiagen植物DNA试剂盒进行提取。提取的DNA用TE溶解,并用琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定所提DNA的纯度与浓度。将各材料DNA浓度稀释到20 ng/μL作为PCR反应体系的模板,置于20 ℃下保存备用。

1.2.2 SSR引物合成及反应条件 根据相关报道[2425],从大麦7条染色体中选择105对SSR引物,以8个麦芽品种的DNA为模板,每对引物重复实验2次,PCR反应体积20 μL,含MgCl22.5 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,正向引物、反向引物各0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0单位,1×PCR缓冲液4 μL(不含Mg2+),样品DNA 20 ng。PCR反应程序为:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 产物分离 扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上110 V恒压电泳分离2 h,最后用硝酸银法进行染色[26]。

1.3 数据处理

对一个给定的SSR引物,不同的品种会同时存在几个等位基因,根据等位基因的大小,最小的定为1,然后根据分子量的大小依次定位为2、3、4等[21],扩增片段的分子量大小根据DNA Marker确定。

2 结果与分析

2.1 多态性引物筛选

从21种麦芽中选择8个来自各国的代表性品种,对7条染色体中选择的105对SSR引物进行多态性分析,综合考虑引物鉴别能力、扩增效果及染色体分布情况,选择多态性高、稳定性好的引物作为初筛引物。根据引物扩增的稳定性及多态性,初筛得到6对带型清晰、重复性好的SSR多态性引物,详见表2。

表2 引物名称及序列信息Table 2 Primer sequences and chromosome locations

2.2 SSR标记多态性分析

利用这6对初筛引物直接对21种麦芽样品进行位点多态性分析。从聚丙烯酰胺凝胶电泳图中选择扩增产物清晰、重复性好的扩增条带作为等位基因位点用于品种多样性分析。结果表明,6对引物共检测出35个等位基因,每对引物的等位基因3～10个不等,平均每个引物产生5.83个等位基因,具有良好的多态性。其中,位点HVM68多态性最丰富,在160～300 bp之间包括10个等位基因,见图1;位点scssr03907多态性其次,在150～200 bp之间含有8个等位基因;位点scssr07759在180～220 bp之间含有4个等位基因,见图2;位点scssr10148多态性最低,在180～270 bp仅含有3个等位基因。这些位点等位基因数量丰富,适用于品种的基因分型,有利于麦芽品种之间的指纹识别和品种区分。

图1 引物HVM68对21种麦芽样品的扩增结果Fig.1 Amplifications of 21 cultivars using primer HVM68注:1～21:Copeland,Newdale,Flagship,Buloke,港啤,Metcalfe,Hindmarsh,Sloop,Cervoise,甘啤4号,垦啤7号,Gairdner,Vlamingh,,Commander,Kendall,Meredith,Baudin,单二,Hamelin,Sebastian,Prestige。

图2 引物scssr07759对21种麦芽样品的扩增结果Fig.2 Amplifications of 21 cultivars using primer scssr07759注:M:DNA Marker,1～21:Metcalfe,Newdale,Kendall,Baudin,Gairdner,Hindmarsh,Buloke,Sloop,Prestige,Meredith,Vlamingh,Sebastian,Commander,Copeland,Hamelin,Flagship,Cervoise,甘啤4号,垦啤7号,单二,港啤。

利用6对SSR引物,可对本研究实验的21种麦芽中的7个品种进行直接区分,如位点scssr07759的等位基因3可将Sloop与其它品种区分开;位点scssr03907的等位基因可直接区分Baudin、Prestige和甘啤4号;位点Bmag0120的等位基因5可将Vlamingh和其它品种区分开;位点HVM68可直接区分Meredith、Hamelin、Sebastian和港啤4个品种。

2.3 DNA指纹图谱的建立

根据SSR扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的相对位置,对每个引物的等位基因带型用阿拉伯数字编号,将每个品种指纹图谱所对应的编码按特定的引物顺序排列起来,就构成了代表各品种身份的特征指纹代码,如在6对引物下加麦Copeland指纹代码为351128,澳麦Gairdner的指纹代码为334845。综合扩增产物的凝胶电泳图谱和等位基因编码,就构成了每个麦芽品种的指纹图谱库,以此作为判定麦芽品种真实性的重要依据。本研究利用6对多态性丰富的SSR引物可准确鉴别的21个麦芽品种,各麦芽品种的特征指纹代码见表3。如检测某麦芽是否是加麦Metcalfe,可先用6对多态性引物对待测麦芽样品和对照Metcalfe的DNA进行PCR扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色,利用DNA标准分子量对待测麦芽的带型进行分析,将带型所对应的代码按引物顺序排列起来,与指纹数据库中标准麦芽Metcalfe的指纹代码和电泳图谱进行比对,即可直观的判定出待测样品是否是Metcalfe,从而实现麦芽品种真实性的判断。

表3 21种麦芽等位基因分析Table 3 The alleles detected for 21 malt varieties

表4 21种麦芽品种区分的等位基因组合Table 4 An allelebased combination for identification of 21 malt varieties

2.4 麦芽品种的区分

21个麦芽品种中,利用HVM68和scssr07759位点可实现14种麦芽的彼此区分,增加scssr03907位点后可区分品种增加到20种。众多位点中HVM68多态性最丰富,包括10个等位基因,可将21种麦芽分成10类,如利用等位基因5可将澳麦Commander和Gairdner与其它品种区分开,结合scssr07759位点可完全区分这两个品种。因此,仅需要4对核心引物(HVM68、scssr07759、scssr03907和Bmac0030)的组合就可以实现21个麦芽品种的区分。研究表明,不同品种麦芽的等位基因的差异不一,同一国家的某些品种较为接近,加麦Metcalfe和Meredith在4个位点上等位基因完全一致,同为国产大麦的单二和港啤在4个位点上等位基因也完全一致。而加麦Metcalfe与澳麦Hindmarsh在两个多态性最丰富的位点HVM68和scssr07759上也完全一致,分别为7415和7414,需要4个位点组合才能完全区分。但随着麦芽品种范围的扩大,6对引物组合的鉴定能力可能会逐渐降低,某些品种间的指纹图谱可能完全相同,就需要增加引物组合的数量来提高品种间的区分能力。因此引物筛选中得到的其它多态性SSR位点,可作为扩展引物提高方法的准确性,也为识别其它麦芽品种提供了更多选择。

3 结论

使用核心引物组合法进行麦芽品种DNA指纹图谱分析,从105对SSR引物中筛选到6对多态性丰富的SSR引物,每对引物的等位基因3～10个不等,平均每个引物产生5.83个等位基因。利用6对多态性丰富的SSR构建21个麦芽品种的指纹数据库,仅需4对核心引物就可以实现21个麦芽品种的区分,该法检测成本低,简单方便。

本课题以麦芽为研究对象,构建国内啤酒企业使用的主要麦芽品种的指纹数据库,在分子水平上给每个品种一个能准确表明其身份的指纹信息,实现主要麦芽品种的真实性鉴定,为啤酒企业的麦芽采购提供技术支持。

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