生鲜食品中蜡样芽孢杆菌毒力基因及耐药性研究

田万帆,张 荣,龙 虎,柳 琳,贺苏皖,杜 玄,蒋 敏,赵 悦,唐俊妮

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041)

蜡样芽孢杆菌在我国细菌性食物中毒中居前三位,是一种需氧、有芽孢、无荚膜、能运动的革兰氏阳性杆菌。该菌广泛存在于自然环境,是剩米饭、剩菜和凉拌菜等引起食物中毒的常见致病菌[1]。蜡样芽孢杆菌引起食物中毒的毒力因子主要为非溶血性毒素(NHE)、溶血性毒素(HBL)、细胞毒素K、肠毒素FM及呕吐毒素(Cereulide)。溶血毒素和非溶血性毒素都是由3个亚基构成的大分子蛋白,是引起腹泻型食物中毒的主要原因,呕吐毒素Cereulide是由(DOLeuDAlaLOValL-Val)3组成的十二肽,耐热、耐酸碱、耐蛋白酶,可引起严重的横纹肌溶解或者肝脏功能衰竭等疾病,也是引起蜡样芽孢杆菌食物中毒的主要原因。肠毒素不耐热,很容易失活,该类型食物中毒并不常见[23]。蜡样芽孢杆菌的毒素可分为呕吐型和腹泻型,目前,针对毒力基因的检测,呕吐型蜡样芽孢杆菌的目标基因为ces和cer;腹泻型蜡样芽孢杆菌的目标基因为entFM,hbl,bceT,nhe和cytK[3]。蜡样芽孢杆菌除引起食物中毒外,还可引发菌血症、心内膜炎、脑膜炎等[4]。因此,了解生鲜食品中蜡样芽孢杆菌携带的毒力基因,有助于掌握蜡样芽孢杆菌的流行病学特征,同时通过对食品蜡样芽孢杆菌分离株进行药敏实验,为合理选用抗生素治疗食源性蜡样芽孢杆菌引起的疾病提供依据。

本研究从成都市农贸市场、路边小摊共采集100份生鲜食品样品,分离鉴定食品中污染的蜡样芽孢杆菌,并对其携带的毒力基因和耐药性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基(MYP)、大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)、MuellerHinton琼脂(MHA) 青岛高科园海博生物技术有限公司;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 杭州微生物试剂有限公司;TE缓冲溶液;TAE缓冲溶液;REGULAR AGAROSE G10型琼脂糖 BIOWEST公司;GELVIEW核酸染料、DL2000 Marker 宝生物工程(大连)有限公司;PCR引物 上海生工公司合成;25 mmol/L MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶 北京擎科新业生物技术有限公司;含药纸片 Oxiod Limited公司;参考菌株:蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63303 上海复祥生物科技有限公司。

DYY6C型电泳仪 北京六一仪器厂;WD800B型微波炉 顺德市格兰仕微波炉电器有限公司;PTC200 PCR仪、Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪 BioRad公司;SWCJ2FD洁净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;UV6100分光光度计 上海美普达仪器有限公司;GHP9080水式恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;HZQF160全温振荡培养箱 江苏省太仓市实验设备厂;AKHLⅢ24艾柯超纯水机 (台湾艾柯)成都康宁实验专用纯水设备;MLS3020电热自动灭菌锅 日本SANYO公司;5804 R型Eppendorf冷冻离心机 Eppendorf中国有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 食品样本采集 在成都市附近的农贸市场和路边小摊采集不同生鲜食品样品100份(其中:农贸市场采集90份,路边小摊10份,样品包括:生肉类25份,蔬菜类44份,凉拌即食类14份,速冻食品类4份,米面制品类9份,全蛋2份,奶粉1份,鲜葡萄1份),每天采集的样品立即送入实验室进行分离鉴定。采样时间为2014年7月至9月。

1.2.2 蜡样芽孢杆菌的培养 分离和纯化所有样品均在无菌条件下进行处理。按照《食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》(GB 4789.142014)进行检验,适当稀释的培养物接种到MYP琼脂平板上(30±1) ℃培养24～48 h,从MYP琼脂平板上挑取疑似菌落,再次纯化并进行鉴定。

1.2.3 蜡样芽孢杆菌的16S rRNA测序鉴定 将纯化的菌株和参考菌株CMCC(B)63303分别接种到TSB培养基中,37 ℃恒温培养8～12 h,采用微波加热法[5]提取菌株DNA。以细菌的16S rRNA通用引物进行PCR扩增,引物序列为:16S27F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;16S1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT[6]。PCR反应体系:10×PCR缓冲液2 μL,Mg2+1.6 μL,dNTP混合液1.2 μL,Taq DNA聚合酶 0.2 μL,模板DNA 1 μL,引物各0.5 μL,无菌去离子水补足体积至20 μL。PCR反应程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 40 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 40 s,72 ℃ 7 min,35个循环。将扩增产物送至成都擎科生物公司进行测序比对。

1.2.4 蜡样芽孢杆菌的毒力基因检测 DNA模板的制备同上,蜡样芽孢杆菌的检测基因的引物序列和扩增片段长度详见表1,PCR反应体系同上,退火温度详见表1,扩增产物采用琼脂糖电泳和凝胶成像系统检测。

表1 蜡样芽孢杆菌的检测基因引物Table 1 The primers of different genes for B. cereus

1.2.5 蜡样芽孢杆菌的耐药性 检测药敏实验根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)推荐的KB纸片扩散法进行操作,实验结果按照CLSI 的标准进行判定。所用抗菌药物及浓度见表2。

表2 18种抗生素药物及其使用浓度Table 2 The concentration of different drugs used in this study

1.3 统计学分析

药敏实验每株菌和每个药片平行重复3次,结果以平均值±SD表示,数据采用SPSS 19. 0统计软件处理。

2 结果与分析

2.1 食品样品中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定结果

蜡样芽孢杆菌在MYP培养基上的形态为粉红色菌落,有2～5 mm沉淀环,菌落较大,表面较为干燥(详见图1)。通过形态学分离鉴定,初步得到24株菌株。进一步对24株菌株进行16S rRNA测序比对,比对结果也证实24株分离菌株均为芽孢杆菌属。农贸市场样品90份,检出17份,检出率为18.9%;路边小摊采样10份,检出7份,检出率为70%。路边小摊食品中的蜡样芽孢杆菌的检出率远高于农贸市场。并且分离的菌株大部分来自于米、面制品及凉拌即食类食品,详见表3的采样记录。

图1 蜡样芽胞杆菌分离菌株在选择性培养基MYP上的菌落形态及16S rDNA测序比对结果Fig.1 The colony morphology on MYP plate and the sequence analysis of 16 S rDNA of B. cereus isolates

表3 蜡样芽孢杆菌分离的样品来源Table 3 The sampling sources of B. cereus isolates

2.2 蜡样芽孢杆菌的毒力基因检测结果

根据PCR检测结果,24株分离菌株在所检测的毒力基因中,呕吐型基因ces和cer的检出率较低,仅在BC4中发现;腹泻型基因nheC在24株中都有检出;cytK有13株检出;bceT有12株检出;hblA有11株检出;nheB有10株检出;hblC、hblD、nheA各有9株检出;hlyⅡ有7株检出;hblB、entFM检出率为0;蜡样芽孢杆菌的看家基因rpoB、gyrB、groEL、vrrA在24株分离菌株中的检出率为100%。参考菌株CMCC(B)63303中检测出nheC基因和四个看家基因。另外,每株分离菌株至少携带1个以上的毒力基因,其中,BC2中携带9个,BC3和BC5菌株各携带8个,BC1携带7个,具体结果详见表4。

表4 蜡样芽孢杆菌分离菌株中毒力基因的分布情况Table 4 The distribution of different virulence genes in B. cereus isolates

2.3 蜡样芽孢杆菌对18种药物的敏感性检测结果

根据药物敏感性检测和判定结果发现,24株被测蜡样芽孢杆菌对18种抗生素存在不同程度的耐药,药物敏感谱详见表5。从表5可以看出,24株蜡样芽孢杆菌对杆菌肽B和磺胺甲亚唑两种药物的耐药率为100%,对苯唑西林、青霉素耐药率分别为96.2%,中介率为3.8%。对阿米卡星的耐药率为0,中介率是19.2%,敏感率是80.8%。对亚胺培南、庆大霉素的耐药率为7.7%,中介率为11.5%,敏感率为80.8%。对呋喃妥因、万古霉素、头孢西丁、利福平的耐药性较相似,耐药率分别为76.9%、65.4%、61.5%、56.7%,敏感率较低,为0和3.8%。对氧氟沙星、四环素、红霉素、环丙沙星、克林霉素、链霉素、氯霉素的耐药率较低均小于40%,且依次降低。

表5 蜡样芽孢杆菌分离菌株对18种药物的敏感性检测结果Table 5 The results of antimicrobial susceptibility test for B. cereus isolates

3 结论与讨论

近年来,蜡样芽孢杆菌引起食物中毒事件的报道逐年增加,其在不同食品中的检测率也较高,如杨媛等[17]从原料乳中分离蜡样芽孢杆菌,检出率为33%;李毅等[18]从温州地区不同食品中分离蜡样芽孢杆菌,检出率为57.4%;章乐怡等[19]从婴幼儿奶粉、米粉的蜡样芽胞杆菌中分离蜡样芽孢杆菌,检出率为71.79%。本研究中,我们一共从农贸市场和路边小摊采集生鲜食品样品100份,采样种类丰富,这些食品中蜡样芽孢杆菌的检出率为24%。其中,路边小摊检出率(70%)远远高于农贸市场(18.9%)。并且,从我们的检测结果来看,米面制品和凉拌食品中蜡样芽孢杆菌的污染情况较为突出。蜡样芽孢杆菌易污染米饭、米粉、凉面等含淀粉丰富的米面制品和凉拌食品[20],夏季凉拌食品所用的配料及原材料长时间暴露在环境中,所售卖的食品卫生难以保证,特别是路边小摊的食品安全问题应当引起有关部门的注意。

针对24株分离菌株携带的毒力基因进行检测,呕吐型蜡样芽孢杆菌检测的目标基因ces和cer只在BC4分离株中发现,检出率较低。尽管entFM基因在所有菌株中未检出,但是引起蜡样芽孢杆菌腹泻的其他目标基因hbl,bceT,nhe和cytK在24株分离菌株中的检测率偏高,要引起重视。四个看家基因groEL、gyrB、rpoB、vrrA在所有菌株中都有检出,也进一步验证了分离菌株的鉴定情况。文献研究表明溶血素hbl基因、非溶血性肠毒素nhe基因、细胞毒素cytK基因是引起腹泻的主要毒力基因,肠毒素entFM基因、肠毒素bceT基因是潜在的腹泻性毒力基因[21]。从我们的毒力基因检测结果可以看出,本次研究所分离的这些菌株如果感染到人引起腹泻的可能性较大,说明采样的生鲜食品引起食物中毒的风险偏高。

24株菌株对杆菌肽B和磺胺甲亚唑两种药物的耐药率为100%,对青霉素类药物的耐药性也较高。这可能与该地区这些抗生素的使用频率有关联。李毅等[18]对温州地区2011～2012年食品中检出的39株蜡样芽孢杆菌进行药敏检测,他们的结果发现39株蜡样芽孢杆菌对四环素和利福平的耐药率较高。庄子慧等[22]对我国不同地区2011年收集的238株蜡样芽孢杆菌进行药敏实验,结果发现食源性蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌对青霉素类药物的抗性也较高。杨移斌等[23]针对罗非鱼源分离的一株蜡样芽孢杆菌进行研究,发现该菌株对苯唑西林、青霉素等10种抗生素耐药。尽管这些不同地区不同来源分离的蜡样芽孢杆菌的耐药情况存在一定差异,但蜡样芽孢杆菌食品源分离菌株的耐药性却不容忽视。

本研究结果为本地区的蜡样芽孢杆菌引起食物中毒的风险评估和治疗措施提供一定的参考价值。另外,建议有关部门加强对生鲜食品流通环节的管理,提升生鲜食品加工卫生水平,改进即食食品安全状况。

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