棘孢木霉液体发酵条件优化

宋巧英,朱振元

(食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

木霉对人类的实用价值和商业价值逐渐被发现,主要因其具有抑菌[1]、产抗生素[2]、产纤维素酶[3]、促生[4]和抗重金属[5]等作用。尤其绿色木霉如棘孢木霉(T.asperellum)、深绿木霉(T.atroviride)、哈茨木霉(T.harzianum)已被人类认识并利用,且商业化木霉已问世[67]。有研究报道绿色木霉具有产纤维素酶的能力[8],其胞外多糖具有诱导癌细胞凋亡的作用[9]。其中棘孢木霉是一类重要的绿色木霉并具有极大的潜力。棘孢木霉可产生不同的细胞壁水解酶如几丁质酶、外切β1,3葡聚糖酶、N乙酰氨基葡萄糖苷酶等[10],且具有促进植物防御体系,抵抗黒荚果病[11]及降解农作物铅含量的作用[12]。传统的棘孢木霉培养方法是固体培养[13],关于棘孢木霉液体发酵条件优化的报道甚少。本实验以菌丝体干重和孢子数为指标，通过单因素、正交实验对棘孢木霉液体摇瓶发酵条件进行优化。旨在降低发酵成本,缩短发酵周期,为棘孢木霉的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

棘孢木霉 天津科技大学生物资源与功能食品实验室在4 ℃冰箱保存;葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、蔗糖、麦芽糖、乳糖、酵母浸粉、牛肉膏、氯化铵、CuSO4、MnCl2、ZnSO4、FeSO4、HCl、NaOH等 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;马铃薯、黄豆粉、绿豆粉、全麦粉 市售。

DSX280KB24手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;202B恒温培养摇床 天津欧诺仪器股份有限公司。

1.2 培养基

马铃薯琼脂培养基(PDA):去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂18 g,蒸馏水1000 mL。

基础培养基:葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸馏水1000 mL。

黄豆粉培养基:黄豆粉0.25%葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸馏水1000 mL。

全麦粉培养基:全麦粉 0.25% 葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸馏水1000 mL。

绿豆粉培养基:绿豆粉 0.25% 葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸馏水1000 mL。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化 将菌种接种到配制好的PDA斜面培养基中,26 ℃,培养3 d,重复三次即可进行扩大培养[14]。

1.3.2 单因素实验

1.3.2.1 不同培养基对菌丝体干重和孢子数的影响 分别取黄豆粉培养基、全麦粉培养基和绿豆粉培养基各100 mL于250 mL锥形瓶中,于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。将活化好的菌种配制成4×108个/mL浓度的孢子悬浮液,每100 mL培养基加样量为2 mL,于26 ℃,160 r/min培养3 d。将锥形瓶取出,摇匀后取1 mL稀释100倍,用血球计数板计数,最后得出每毫升发酵液中孢子数,为数据处理方便,以孢子数对数值为指标。然后将发酵液摇匀进行抽滤,得到菌丝体,将菌丝体烘干至恒重,称量菌丝体的质量,计为菌丝体干重。每个处理设三个重复,结果取其平均值,并计算其标准差。

1.3.2.2 黄豆粉量对菌丝体干重和孢子数的影响 根据上述筛选出的黄豆粉培养基来确定黄豆粉最佳量。在基础培养基中分别配制含有黄豆粉0.1%,0.2%,0.25%,0.3%,0.35%,0.4%,0.5%的培养基,按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.3 不同碳源对菌丝体干重和孢子数的影响 当黄豆粉添加量为0.25%,黄豆粉培养基中分别用2%的蔗糖、麦芽糖、乳糖代替葡萄糖,并做对照。按照1.3.2.1的方法测定孢子数和干重。

1.3.2.4 葡萄糖添加量对菌丝体干重和孢子数的影响 当葡萄糖为碳源,黄豆粉培养基中的葡萄糖分别设置为1.0%、2.0%、3.0%、4.0%,按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.5 不同氮源对菌丝体干重和孢子数的影响 当葡萄糖添加量为3.0%,在筛选出的黄豆粉培养基中分别用0.25%的酵母浸粉、牛肉膏、氯化铵代替蛋白胨,并做对照。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.6 蛋白胨添加量对菌丝体干重和孢子数的影响 当蛋白胨为氮源,黄豆粉培养基中的蛋白胨添加量分别设置为0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%,按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.7 不同微量元素对菌丝体干重和孢子数的影响 当蛋白胨添加量为0.75%,黄豆粉培养基中分别用0.15%的CuSO4、MnCL2、ZnSO4、FeSO4代替MgSO4,并做对照。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.8 Mg2+添加量对菌丝体干重和孢子数的影响 当MgSO4为微量元素,黄豆粉培养基中的Mg2+添加量分别设置为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%,按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.9 光照条件对菌丝体干重和孢子数的影响 当Mg2+添加量为0.15%,黄豆粉培养基分别置于完全光照,完全黑暗,自然光照中培养3 d。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.10 温度对菌丝体干重和孢子数的影响 当自然光照棘孢木霉生长,黄豆粉培养基分别置于20、25、30、35 ℃中培养3 d。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.11 初始pH对菌丝体干重和孢子数的影响 当适合棘孢木霉生长温度为25 ℃,用0.1 mol/L的HCl和NaOH调节筛选出的最佳培养基的pH,将上述筛选出的黄豆粉培养基的初始pH分别调整为4、6、7、9、11。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.12 装瓶量对菌丝体干重和孢子数的影响 当适合棘孢木霉生长的培养基初始pH为7时,黄豆粉培养基按每250 mL锥形瓶装液量分别为40、60、80、100、120、160 mL进行培养。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.2.13 接种量对菌丝体干重和孢子数的影响 当装瓶量为100 mL时,黄豆粉培养基接种量分别按0.5×106、1×106、2×106、4×106、8×106、16×106个/mL进行培养。按照1.3.2.1的方法测定干重和孢子数。

1.3.3 正交实验设计因素水平 由上述实验可知,接种量、装瓶量、蛋白胨添加量和葡萄糖添加量对干重和孢子数的影响较为显著。因此在单因素基础上将这四个因素作为正交实验设计因素,正交表见表1。

表1 棘孢木霉发酵因素水平Table 1 Factors and levels affecting the fermentation of Trichoderma asperellum

1.4 数据处理

数据分析采用EXCEL和SAS 9.3软件进行分析,实验数据以平均值±标准差表示。组间差异用Duncan检验。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 不同培养基对菌丝体干重和孢子数的影响 由表2可知,棘孢木霉在不同培养基中均能生长,且在黄豆粉培养基中生长最旺:菌丝体干重为8.822 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为7.3281。其次是绿豆粉培养基,而在全麦粉培养基中生长最弱。由于黄豆粉中含有大量的蛋白质和碳水化合物,为棘孢木霉的生长提供额外的碳源和氮源。因此选取黄豆粉培养基为培养基。

表2 不同培养基对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 2 Effects of different media on the number and dry weight of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.2 黄豆粉量对菌丝体干重和孢子数的影响 由表3可知,黄豆粉量的不同对菌丝体干重和孢子数的影响有显著性差异(p<0.05)。随着黄豆粉量的增加,菌丝体干重和孢子数呈现先增大后减小的趋势。其中黄豆粉量为0.25%时,干重和孢子数达到最大,其中干重为12.704 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.6232。因此黄豆粉为0.25%。

表3 黄豆粉量对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 3 Effects of soybean powder on dryweight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.3 不同碳源对菌丝体干重和孢子数的影响 由表4可知不同的碳源对菌丝体干重的影响有极显著性差异(p<0.01),对孢子数有显著性差异(p<0.05)。其中葡萄糖作为碳源培养基所得菌丝体干重和孢子数达到最大,干重为9.974 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.7782。由于葡糖糖可以被棘孢木霉直接利用,因此选取葡萄糖为碳源。

表4 不同碳源对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 4 Effects of carbon source on dry weight and spore number of mycelia

2.1.4 葡萄糖添加量对菌丝体干重和孢子数的影响 由表5可知葡萄糖添加量对菌丝体干重的影响有极显著性差异(p<0.01),对孢子数有显著性差异(p<0.05)。菌丝体干重和孢子数随着葡萄糖量的增加呈现先增加后减少的趋势。其中葡萄糖量为3.0%时菌丝体干重最大,达到16.672 g/L,当葡萄糖量为2%时每毫升发酵液中孢子数达到最大为8.7782。这是由于葡萄糖添加量增多或减少会导致培养基的碳氮比失衡,因此葡萄糖添加量为3.0%。

表5 葡萄糖添加量对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 5 Effects of glucose addition on dry wight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.5 不同氮源对菌丝体干重和孢子数的影响 由表6可知不同氮源对菌丝体干重的影响有显著性差异(p<0.05),对孢子数有极显著性差异(p<0.01)。其中蛋白胨作为氮源的培养基所得菌丝体干重和孢子数达到最大值。干重为10.989 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.6127。因此选取蛋白胨为氮源。

表6 不同氮源对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 6 Effects of different nitrogen sources on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.6 蛋白胨添加量对菌丝体干重和孢子数的影响 由表7可知蛋白胨的添加量对菌丝体干重无显著影响(p>0.05)，而对孢子数有显著性影响(p<0.05)，菌丝体干重和孢子数随着蛋白胨量的增加呈现增加趋势。当蛋白胨量为1.25%时干重和孢子数最大，其中干重为12.455 g/L，每毫升发酵液中孢子数对数值为8.3010。因此蛋白胨添加量为1.25%。

表7 蛋白胨添加量对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 7 Effects of peptone additive on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.7 不同微量元素对菌丝体干重和孢子数的影响 由表8可知不同微量元素对菌丝体干重的影响有显著性差异(p<0.05)。其中MgSO4作为微量元素的培养基所得菌丝体干重和孢子数达到最大值,干重为8.709 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.5051。因此选取MgSO4为微量元素。

表8 不同微量元素对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 8 Effects of different trace elements on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.8 Mg2+添加量对菌丝体干重和孢子数的影响 由表9可知Mg2+添加量对菌丝体干重有显著性影响(p<0.05),对孢子数对数值有极显著性影响(p<0.01)。菌丝体干重和孢子数随着Mg2+添加量的增加呈现先增加后减少的趋势。其中当Mg2+添加量为0.15%时,干重和孢子数对数值达到最大值,干重为9.752 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.1139。所以Mg2+添加量为0.15%。

表9 Mg2+添加量对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 9 Effects of Mg2+ on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.9 光照条件对菌丝体干重和孢子数的影响 由表10可知光照条件对干重和孢子数有极显著性影响(p<0.01)。其中自然光照条和全光照条件下菌丝体干重和孢子数无差异(p>0.01)。由于自然光照会降低成本,因此选取自然光照条件下进行发酵,干重为13.885 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.3792。

表10 光照条件对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 10 Effects of light conditions on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.10 温度对菌丝体干重和孢子数的影响 由表11可知,温度对干重和孢子数有极显著性影响(p<0.01)。其中当温度为25 ℃时,干重和孢子数对数值达到最大,干重为13.956 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.1968。所以选取发酵温度为25 ℃。这和李琳实验结果一致[14]。

表11 温度对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 11 Effects of temperature on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.11 初始pH对菌丝体干重和孢子数的影响 由表12可知,初始pH对菌丝体干重和孢子数有显著性影响(p<0.05)。其中当pH为7时,菌丝体干重和孢子数达到最大值,干重为8.200 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.6127。由于培养基过酸或过碱都会破坏棘孢木霉酶活性,因此选取初始pH为7。

表12 初始pH对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 12 Effects of initial pH on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.12 装瓶量对菌丝体干重和孢子数的影响 由表13可知装瓶量对菌丝体干重和孢子数有显著性影响(p<0.05)。菌丝体干重和孢子数随着装瓶量的增加呈现先增加后减少的趋势。其中当装瓶量为100 mL/250 mL时,菌丝体干重和孢子数达到最大,每毫升发酵液中菌丝体干重为13.737 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.8445。因为100 mL/250 mL装瓶量会使氧气充足同时营养条件合适,所以选取装瓶量为100 mL/250 mL。

表13 装瓶量对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 13 Effects of bottling amount on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.13 接种量对菌丝体干重和孢子数的影响 由表14可知接种量对菌丝体干重有极显著性影响(p<0.01),对孢子数有显著性影响(p<0.05)。菌丝体干重和孢子数随着接种量的增加呈现先增加后减少的趋势。其中当接种量为8×106个/mL时,干重和孢子数达到最大值,干重为15.196 g/L,每毫升发酵液中孢子数对数值为8.7993。所以选取接种量为8×106个/mL。

表14 接种量对菌丝体干重和孢子数的影响(x±SD,n=3)Table 14 Effects of inoculation amount on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.2 正交实验结果与分析

由表15可以看出,对干重的影响的显著顺序依次为:装瓶量>葡萄糖添加量>接种量>蛋白胨添加量,四个因素的最佳组合为A2B4C4D4。对孢子数的影响的显著顺序依次为:葡萄糖添加量>接种量>装瓶量>蛋白胨添加量,四个因素的最佳组合为A2B4C4D4。所以,得到的最佳培养基配方为:黄豆粉0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,接种量8×106个/mL,装瓶量100 mL/250 mL,蛋白胨添加量1.35%,葡萄糖添加量3.5%,转速160 r/min,温度25 ℃,自然光照,pH为7。

表15 正交实验结果与分析Table 15 Results and analysis of orthogonal test

3 结论

基于棘孢木霉的巨大潜力,对棘孢木霉的液体发酵条件进行优化。通过单因素正交实验确定液体发酵最优条件为:黄豆粉0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,接种量8×106个/mL,装瓶量100 mL/250 mL,蛋白胨添加量1.35%,葡萄糖添加量3.5%,转速160 r/min,温度25 ℃,自然光照,pH为7。以黄豆粉浸提液为主要培养基是因为黄豆粉来源丰富,营养丰富,价格低廉。在微量元素利用方面,Fe2+和Cu2+会抑制菌丝体和孢子数的增长,这和柯仿钢[15]等的实验结果一致。在装瓶量方面,100 mL/250 mL的装瓶量为最佳装瓶量,这是因为氧气充足,且营养条件合适,适合菌体生长,这和李琳[12]实验结果一致。虽然武为平[16]等也研究了棘孢木霉产厚垣孢子的液体发酵条件,其产孢量达到5×107个/mL,本研究的产孢量为4.4812×109个/mL,因此本研究的发酵条件优化成效显著。这对于棘孢木霉的综合开发和利用具有重要的价值。为棘孢木霉的工业化生产打下理论基础。

表16 验证实验(x±SD,n=3)Table 16 Verify the experiment(x±SD,n=3)

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