母乳挥发性成分固相微萃取-气质联用检测条件的优化及测定

高雅慧,李子杰

(1.江南大学食品学院,江苏无锡 214122;2.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122)

母乳是婴儿最天然、最安全、最理想的食物来源,被称为人类的“白色血液”。对婴儿来说,肠道菌群尚未完全形成,其肠道、呼吸道容易受到感染,母乳对于维持婴儿的健康具有至关重要的作用[1]。同婴幼儿配方奶粉相比,母乳喂养婴儿的病死率显著降低[24]。母乳喂养除了能促进婴儿生长和神经系统发育外,对肥胖、高血压、高血脂、II型糖尿病等疾病均有一定的预防作用[56]。此外,母乳中所特有的活性物质及微生物,对于增强婴儿免疫力和肠道菌群的建立起着重要作用[712]。

母乳喂养具有人工喂养无法比拟的优点,但相当一部分母亲由于工作或身体的原因而不能持续进行母乳喂养,只能选取婴幼儿配方奶粉作为母乳的最佳替代品。然而,长期喝母乳的婴儿很难在短期内适应配方奶粉的风味,因此测定母乳所特有的挥发性成分具有重要意义。近年来对母乳的研究主要集中于对母乳中某些特定营养成分的研究,比如脂肪酸、核苷酸、免疫因子等活性物质[1317],对母乳挥发性物质的研究还未见相关报道。

本研究采用顶空固相微萃取气质联用法(SPMEGCMS)测定母乳的挥发性物质,通过单因素实验法对萃取头的选择、萃取量、盐效应、萃取温度和时间、解析时间进行优化,从而得到母乳挥发性成分SPMEGCMS检测的较优条件,揭示影响母乳风味的主要挥发性成分,为母乳配方奶风味的改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜母乳 源于产后6个月的28岁母亲,放置于母乳保鲜袋中,于4度冰箱保存；NaCl 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

萃取头:100 μm PA(polyacrylate),100 μm PDMS(polydimethylsiloxane),75 μm CAR/PDMS(carboxenpolydimethylsiloxane),65 μm DVB/PDMS(divinylbenzenpolydimethylsiloxane),50/30 μm CAR/DVB/PDMS(carboxendivinylbenzenpolydimethylsiloxane)涂层的萃取头 美国Supelco公司;三重四级杆气质联用仪(GCMS) TriPlus RSHTrace GC ULTRATSQ Quantum XLS 全自动进样气相色谱(三重四级杆)质谱联用仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 萃取头老化方法 将使用的五种固相萃取头设置于TriPlus上的Fiber Conditioning Station中老化至没有杂峰,老化温度250 ℃,老化时间30 min。

1.2.2 萃取条件 取适量的液体母乳于20 mL的螺口玻璃瓶中,加入适量的NaCl,在TriPlus的Agitator中设置适当的温度平衡2 min,插入固相萃取头吸附平衡,最后于GC进样口解析。本实验中分别选用了100 μm PA,100 μm PDMS,75 μm CAR/PDMS,65 μm DVB/PDMS,50/30 μm CAR/DVB/PDMS五种萃取头进行实验,母乳萃取量为4 mL,NaCl加入量为1.0 g,在45 ℃下恒温萃取30 min,解析时间5 min,研究不同萃取头对萃取效果的影响;根据萃取头的优化结果,选用DVB/PDMS,萃取温度40 ℃,萃取30 min,解析5 min,母乳的萃取量为1、2、3、4、5、6 mL,研究萃取量对总峰面积及出峰数的影响;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的顶空瓶中,分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g NaCl固体,充分混匀至NaCl能够溶解或饱和,萃取温度40 ℃,萃取时间30 min,解析时间5 min,研究盐效应对总峰面积及出峰数的影响;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的顶空瓶中,加入1.5 g NaCl固体,分别在40、45、50、55、60、65 ℃萃取30 min,解析5 min,研究萃取温度对总峰面积及出峰数的影响;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的顶空瓶中,加入1.5 g NaCl固体,在60 ℃下分别萃取10、20、30、40、50、60 min,解析5 min,研究萃取时间对总峰面积及出峰数的影响;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的顶空瓶中,加入1.5 g NaCl固体,在60 ℃萃取30 min,分别解析1、3、5、7、9、11 min,研究解析时间对总峰面积及出峰数的影响。所有样品3次平行。

1.2.3 GCMS参数条件

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱:毛细管色谱柱(TR-WAXMS 30 m×0.25 mm×0.25 mm);升温程序:起始柱温40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min上升至120 ℃,再以10 ℃/min上升至240 ℃,保持8 min。载气是高纯氦气,流速是1.0 mL/min;不分流模式,进样口温度为250 ℃,传输线温度为240 ℃[18]。

1.2.3.2 质谱条件 电子轰击(EI)离子源:电子能量70 eV;离子源温度是240 ℃;灯丝电流50 μA;质量扫描范围(m/z):33～450 u[18]。

1.2.4 定性定量方法 定性方法:经过软件检索,同时结合NIST library的配比度,本实验仅对相似度大于800(最大值是1000)的鉴定结果进行分析。定量方法:根据峰面积归一化计算[18]。

2 结果与讨论

2.1 萃取头的优选

不同萃取头由于其涂层极性的不同,所能吸附的物质种类和极性也不同。极性涂层对酸类和酚类物质等极性物质有较好的吸附性,非极性涂层对非极性物质具有较好的吸附效果,因而不同类型的物质需要选择合适的萃取头进行实验。通过单因素方差分析,不同的萃取头对萃取效果具有极显著性差异(p<0.01)。结果如图1所示,DVB/PDMS所得到物质的总峰面积及出峰数远远高于PA、PDMS和CAR/PDMS,比CAR/DVB/PDMS略高。可能的原因是DVB/PDMS萃取头具有两极性质[19],对多种物质具有好的吸附效果,因此萃取头的选择类型为DVB/PDMS。

图1 萃取头的种类对萃取效果的影响Fig.1 Effect of extraction fibers on extraction efficiency

2.2 萃取量对萃取效果的影响

本实验所用的萃取瓶的总容积是20 mL,母乳萃取量的多少会影响萃取挥发性物质的总峰面积及出峰数。如果样品量太少,萃取头得不到充分的吸附,萃取的挥发性物质就少;如果样品量过多,则由于样品挤压没有充分的挥发面积和萃取头无法过量吸附,导致萃取的挥发性物质在一定萃取量之后趋于平稳或者有所下降。通过单因素方差分析,不同的样品量对萃取效果具有极显著性差异(p<0.01)。结果如图2所示:萃取量的增大引起总峰面积及出峰数也随之增大;当萃取量达到5 mL时出现最大总峰面积及出峰数,当萃取量达到6 mL时,总峰面积没有明显的上升(p>0.05)且出峰数略有下降。因此母乳较优的萃取量为5 mL。

图2 萃取量对萃取效果的影响Fig.2 Effect of sample volumes on extraction efficiency

2.3 盐效应对萃取效果的影响

为了提高萃取的灵敏度,通常通过采用盐析手段来提高基体溶液中的极性有机化合物在吸附涂层中的吸附系数从而达到更高的吸附率,但无机盐的过量加入会增加基质的黏度,降低物质的扩散速度,产生负效应[20]。通过单因素方差分析,不同NaCl的添加量对萃取效果具有极显著性差异(p<0.01)。结果如图3所示:NaCl含量的增多引起总峰面积也相应升高,当NaCl含量达到1.5 g 时总峰面积及出峰数最高,之后趋于平衡,这说明1.5 g NaCl在5 mL的样品中使挥发性有机物达到最大逸出量,因此在5 mL的母乳中选择1.5 g NaCl为宜。

图3 NaCl的添加量对萃取效果的影响Fig.3 Effect of additive amount of sodium chloride on extraction efficiency

2.4 萃取温度对萃取效果的影响

萃取温度也会影响总峰面积且具有双重影响。一方面,随着温度的升高,增强被萃取物的挥发性,进而提高分析物在顶空中的分配,减少平衡时间,提高分析速率;另一方面,温度过高使得萃取头的固有涂层脱附,降低分析物在涂层与样品中的分配系数,从而减少萃取头的吸附量,影响总峰面积。通过单因素方差分析,不同的萃取温度对萃取效果具有极显著性差异(p<0.01)。结果如图4所示:伴随着温度的升高,总峰面积和出峰数相继增大,当温度升到60 ℃时,总峰面积和出峰数达到最高值随后下降,因此较优的萃取温度是60 ℃。

图4 萃取温度对萃取效果的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.5 萃取时间对萃取效果的影响

萃取时间的长短跟样品的分配系数、挥发物质的扩散速度、萃取头的种类和膜厚及其吸附能力、样品的体积等因素有着密切的关系。结果如图5所示:萃取时间的延长引起总峰面积和出峰数快速增大(p<0.01),30 min时达到最大值,而后有所减小。这表明过长时间的萃取可能造成组分之间的化学反应,不仅影响萃取效果,还对萃取头有一定的影响。此实验中,较优的萃取时间为30 min。

图5 萃取时间对萃取效果的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.6 解析时间对GCMS检测的影响

解析时间与萃取头的膜厚、长短及解析的完全程度相关,萃取头越长或膜厚越厚,其解析时间一般有所增加。若解析不完全则会影响方法的灵敏度,同时也会影响下一个样品的检测分析。若解析时间过度则会对萃取头有一定的损害。通过单因素方差分析,不同的解析时间对GCMS检测具有极显著性差异(p<0.01)。结果如图6所示:解析时间的延长引起总峰面积及出峰数继而增大,在解析5 min之后峰面积变化不大(p>0.05),因此较优的解析时间选择为5 min。

图6 解析时间对GCMS检测的影响Fig.6 Effect of desorption duration on GCMS detection

2.7 母乳挥发性成分分析

在上面筛选出的较优条件下对母乳挥发性成分进行了测定,挥发性成分及相对含量见表1。分析得到34种挥发性成分,其中烯烃类最多,有14种(总含量为74.97%),其中右旋萜二烯和萜品烯的含量分别占挥发性物质总含量的47.68%和12.44%;酸类有5种(总含量为15.54%)、相对含量较高的有癸酸(6.77%)和辛酸(5.43%);酯类有8种(总含量为4.25%),相对含量较高的是癸酸乙酯(1.13%);芳香烃类有4种(总含量为3.91%),相对含量较高的为二甲苯(2.53%);酮类3种(总含量为1.33%),相对含量较高的为乙偶姻(0.8%)。由此可见右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要挥发性成分,酸类、酯类、芳香烃类和酮类是母乳特殊风味的重要组成部分。

表1 母乳的挥发性成分及其相对含量Table 1 Volatile compounds and relative contents of breast milk

羊奶中含有42种挥发性物质,其中酸类物质最多,有14种,包括10种短链脂肪酸,含量较高的是己酸、辛酸和癸酸,占挥发性成分的68%,可能和羊奶特有的膻味有关[18]。除了酸类物质外,还含有6种酯类物质,和羊奶特殊的香气有关[18]。此外,挥发性物质还包括烷烃、芳香族、醇、醛酮和杂环类化合物,相对含量较高的有丙酮、苯甲醛等[18]。酸牛奶挥发性物质主要有酸类(28%)和酮类(29%),酸类物质对酸牛奶的风味强度影响较大,酮类物质赋予酸牛奶特征性的风味,属于酮类物质的乙偶姻是酸牛奶中含量最高的挥发性物质(13.4%)[21]。

3 结论

本研究利用单因素实验分析了影响SPMEGC-MS检测的6个因素,确定了母乳挥发性成分的检测条件为DVB/PDMS萃取头、样品量 5 mL、添加 1.5 g NaCl、萃取温度60 ℃、萃取时间30 min、解析时间5 min,在此较优检测条件下分析得到34种挥发性成分,其中烯烃类14种、酸类5种、酯类8种、芳香烃类4种、酮类3种。右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要挥发性成分,本研究将为改善配方奶的风味提供一定的理论依据。

[1]Jeurink P V,van Bergenhenegouwen J,Jimenez E,et al. Human milk:A source of more life than we imagine[J]. Beneficial Microbes,2013,4(1):1730.

[2]Jacobi S K,Odle J. Nutritional factors influencing intestinal health of the neonate[J]. Advances in Nutrition,2012,3(5):687696.

[3]Newburg D S,Ruizpalacios G M,Morrow A L.Human milk glycans protect infants against enteric pathogens[J].Annual Review of Nutrition,2005,25(25):3758.

[4]Collado M C,Rautava S,Isolauri E,et al. Gut microbiota:A source of novel tools to reduce the risk of human disease?[J]. Pediatric Research,2015,77(1/2):182188.

[5]张道文,刘超,蔡可英. 母乳喂养对儿童期肥胖的影响[J].国际内分泌代谢杂志,2013,33(1):2931.

[6]Hassiotou F,Geddes D T. Immune cellmediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding[J]. Advances in Nutrition,2015,6(3):267275.

[7]赵洁,孙天松. 母乳对婴儿肠道菌群及免疫系统影响的研究进展[J].食品科学,2017,38(1):289296.

[8]Mohammed A,Hartmann P E,Geddes D T,et al. MicroRNAs in breast milk and the lactating breast:Potential immunoprotectors and developmental regulators for the infant and the mother[J]. International Journal of Environmental Research & Public Health,2015,12(11):1398114020.

[9]PerezCano F J,Dong H,YAQooB P.Invitroimmunomodulatory activity ofLactobacillusfermentum CECT5716 andLactobacillussalivariusCECT5713:Two probiotic strains isolated from human breast milk[J]. Immunobiology,2010,215(12):9961004.

[10]GomezGallego C,Frias R,Bernal M J,et al.Polyamine supplementation in infant formula:Influence on lymphocyte populations and immune systemrelated gene expression in a Balb/cOlaHsd mouse model[J].Food Research International,2014,59(4):815.

[11]Yu Z T,Chen C,Kling D E,et al. The principal fucosylated oligosaccharides of human milk exhibit prebiotic properties on cultured infant microbiota[J].Glycobiology,2013,23(2):169177.

[12]Yu Z T,Chen C,Newburg D S. Utilization of major fucosylated and sialylated human milk oligosaccharides by isolated human gut microbes[J]. Glycobiology,2013,23(11):12811292.

[13]LópezLópez A,LópezSabater MC,CampoyFolgoso C,et al.Fatty acid and sn2 fatty acid composition in human milk from Granada(Spain)and in infant formulas[J].European Journal of Clinical Nutrition,2002,56(12):12421254.

[14]Martin J C,Bougnoux P,Antoine J M,et al.Triacylglycerol structure of human colostrum and mature milk[J].Lipids,1993,28(7):637643.

[15]Fidler N,Koletzko B.The fatty acid composition of human colostrums[J].European Jonrnal of Nutrition,2000,39(1):3137.

[16]Koletzko B,RodriguezPalmero M.Polyunsaturated fatty adds in human milk and their role in early infant development[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,1999,4(3):269284.

[17]张婷婷,曾明飞,金燕,等.反相高效液相色谱串联质谱法测定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量[J]. 分析化学,2014,42(4):585591.

[18]艾对,张富新,于玲玲,等. 羊奶中挥发性成分顶空固相微萃取条件的优化[J].食品与生物技术学报,2015,34(1):4046.

[19]Filho A M,Santos F N,Pereira P A.Development,validation and application of a methodology based on solidphase micro extraction followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry(SPME/GCMS)for the determination of pesticide residues in mangoes[J].Talanta,2010,81,346354.

[20]王海滨,徐骅,李芸.固相微萃取技术及其应用现状综述[J].上海环境科学,2006,25(6):260262.

[21]刘南南,郑福平,张玉玉,等. SAFEGCMS分析酸牛奶挥发性成分[J].食品科学,2014,35(22):150153.