高效液相色谱法测定甘蓝泡菜发酵过程中的有机酸

王芮东,李 楠,卫博慧,史 露

(1.运城学院理科实验中心,山西运城 044000;2.运城学院生命科学系,山西运城 044000)

泡菜,是以新鲜蔬菜为原料,经乳酸菌发酵而成的一种低盐发酵食品[14]。它含有丰富的维生素、氨基酸[5],及乳酸、乙酸、苹果酸等多种有机酸[69],其酸鲜纯正、脆嫩芳香,具有解腻开胃等多种功效,受到众多消费者的青睐,其中,有机酸是反映泡菜发酵程度的重要指标,可以提高泡菜的风味,其含量的多少与泡菜的品质密切相关。

目前,有机酸定量分析的方法有滴定法、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、薄层色谱法、离子排斥色谱法(IC)、高效液相色谱法(HPLC)等[1015],其中HPLC法因具有高效快速、灵敏度高、稳定性好等优点而被普遍的使用,目前HPLC法用于分析泡菜中有机酸的研究较少,刘冬梅等[16]用高效液相色谱法对泡菜中L乳酸和D乳酸进行手性分离和测定,王冉等[17]用反相高效液相色谱法测定泡菜中的7种有机酸含量。这些方法测定的有机酸种类偏少,不利于更好检测泡菜中的有机酸种类及含量。

本实验建立了HPLC法同时测定泡菜中9种有机酸含量的方法,并对甘蓝泡菜在自然发酵过程中有机酸的种类和数量进行了研究,还对其总酸、pH变化进行了分析,以期为改善泡菜的营养价值、口感风味及泡菜生物功能检测提供理论依据,从而更好地控制泡菜生产过程和产品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘蓝、白砂糖、蒜、姜、辣椒、花椒、大料等 运城市华联超市;海藻精制加碘盐 中盐上海市盐业公司;磷酸二氢钾、磷酸、氢氧化钠、柠檬酸、琥珀酸 均为分析纯,天津市大茂化学试剂厂;95%乙醇、草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、抗环血酸、丙酸 均为分析纯,天津市瑞金特化学品有限公司;甲醇 色谱纯,天津市大茂化学试剂厂。

LC1200型高效液相色谱仪(VWD紫外检测器) 美国Agilent公司;PHS3E型pH计 上海佑科仪器有限公司;TDL6M型大型离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;JJ/2型组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;TG16MW台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;KQ-300GDV型数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜制备 原料选择及预处理:挑选新鲜、无蛀虫、无腐烂的甘蓝为原料,洗净、晾干、切分。

卤水配制:将水烧开,加入盐、糖配制成盐、糖浓度分别为6%、4%的溶液,冷却至室温。

装坛:按甘蓝菜与卤水质量比1∶2的比例进行装坛,并加入蒜、姜、花椒等辅料。

密封发酵:密封,室温条件下发酵11 d。

1.2.2 有机酸测定方法的建立

1.2.2.1 有机酸提取 参照叶秀娟等[18]的方法并加以改进。准确称取发酵的泡菜和汁液各10 g,一起放入组织捣碎机中捣碎成浆,然后以3850 r/min离心10 min,准确吸取上清液10 mL加15 mL超纯水,于70 ℃超声波中提取15 min,再以12000 r/min离心10 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤后,置于2 mL样品瓶中待色谱测定。

1.2.2.2 色谱条件 色谱柱:Agilent TCC18(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测器:VWD检测器;流动相:甲醇0.01 mol/L磷酸二氢钾(3∶97)(用磷酸调节pH=2.80);检测波长:210 nm;流速:1 mL/min;进样量:10 μL;柱温:25 ℃。

1.2.2.3 标准曲线绘制 精密称取草酸、抗坏血酸各18 mg,苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸各300 mg,酒石酸75 mg,丁二酸700 mg,丙酸3000 mg,用甲醇与0.01 mol/L磷酸二氢钾体积比为3∶97的溶液溶解并定容至50 mL的容量瓶,得到0.36 mg/mL的草酸、抗坏血酸、6 mg/mL苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、1.5 mg/mL酒石酸、14 mg/mL丁二酸、60 mg/mL丙酸的有机酸标准储备液。将其用流动相稀释为2、4、6、8、10、12倍,得到不同浓度梯度的有机酸标准溶液,经0.22 μm滤膜过滤至2 mL进样瓶中,进样分析,绘制峰面积质量浓度标准曲线,求回归方程和相关系数。

1.2.2.4 精密度测定 取有机酸标准储备液稀释10倍后的标准溶液连续进样6次,根据所得峰面积分别计算其精密度(以相对标准偏差表示)。

1.2.2.5 重复性测定 精密称取同一份样品6份(每份泡菜和汁液各10 g),分别预处理后进行色谱分析,计算相对标准偏差。

1.2.2.6 回收率测定 精密称取发酵第6 d的样品泡菜和汁液各10 g,按1.2.2.1方法制备有机酸提取液,准备同一有机酸提取液2份(各5 mL),其中1份作为本底,另1份添加有机酸标准溶液5 mL,分别预处理后进行色谱分析,计算各有机酸的加标回收率。

1.2.3 样品的测定

1.2.3.1 有机酸含量测定 按照1.2.2的方法,对第0～11 d的泡菜样品各有机酸含量进行测定,每个样品平行3次,求平均值。

1.2.3.2 总酸度测定 采用酸碱滴定法[19],每个样品平行3次,求平均值。

1.2.3.3 pH测定 采用精密pH计测定[20],每个样品平行3次,求平均值。

1.3 数据分析

在Agilent ChemStion工作站,根据色谱图中各峰的保留时间和内标法进行定性分析,根据峰面积和标准曲线对样品中有机酸进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 有机酸标准混合液HPLC分析

在上述色谱条件下,有机酸标准混合溶液的高效液相色谱图见图1。

图1 有机酸混合标样的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of organic acid standards注:苹果酸有D苹果酸和L苹果酸两种结构,二者总量记为苹果酸总量。

由图1可知,9种有机酸的出峰情况为:草酸(3.311 min)、酒石酸(3.737 min)、苹果酸(D苹果酸：4.746 min、L苹果酸：9.388 min)、抗坏血酸(5.316 min)、乳酸(5.527 min)、乙酸(5.945 min)、柠檬酸(8.402 min)、丁二酸(10.034 min)、丙酸(13.643 min)。

2.2 标准曲线绘制

以各有机酸组分质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到各有机酸的回归方程及相关系数,结果见表1。

表1 有机酸标准曲线的线性参数Table 1 Regression equations and correlation coefficients for organic acids

由表1可知,9种有机酸在0.030～7.000 mg/mL线性范围内,相关系数(R2)在0.9917～0.9996,表明各有机酸的峰面积与质量浓度的线性相关性良好,此条件下可以很好地测定有机酸含量。

2.3 精密度

由表2可知,9种有机酸的相对标准偏差(RSD)范围在0.06%～0.26%,表明该方法的精密度良好。

表2 测定方法的精密度(n=6)Table 2 Precision of the method(n=6)

2.4 重复性

由表3可知,该方法6次实验的RSD在0.67%～4.85%之间,表明该方法的重复性均达到分析要求。

表3 测定方法的重复性(n=6,mg/mL)Table 3 Repeatability of the method(n=6,mg/mL)

2.5 回收率

由表4可知,9种有机酸的回收率为95.23%～104.76%之间,说明该方法的准确度较高。

表4 有机酸加标回收率Table 4 Recovery of the organic acids

2.6 泡菜样品中有机酸的测定结果

泡菜发酵第3 d的样品色谱图见图2,第0～11 d泡菜样品中有机酸组成及含量见表5。

表5 发酵过程中泡菜样品有机酸含量(mg/mL)Table 5 Contents of each organic acid in kimchi during fermentation(mg/mL)

图2 泡菜第3 d的有机酸的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of organic acids at the third day in kimchi

由图2可知:第3 d中泡菜样品中有机酸:草酸(3.415 min)、酒石酸(3.858 min)、苹果酸(4.728 min)、抗坏血酸(5.042 min)、乳酸(5.495 min)、乙酸(6.411 min)、柠檬酸(7.512 min)、丁二酸(10.129 min)、丙酸(12.621 min)。

从表5可以看出,泡菜发酵过程中有机酸的种类及含量随发酵时间延长而一直变化。在发酵第0 d未检测到丙酸,第1 d后9种有机酸均被检测到;发酵过程中草酸含量一直最高,乳酸次之;草酸含量在第0～6 d呈下降趋势,第6 d后变化不大;酒石酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸与丁二酸从第0 d至5～7 d呈上升趋势,上升到最高点后呈整体下降趋势;苹果酸在第0～6 d呈先下降后上升趋势,6 d之后变化起伏较大;柠檬酸在第0～4 d呈下降趋势,4 d后呈上升趋势;丙酸在第0～7 d呈先下降后上升趋势,7 d之后基本保持在一定水平。从各有机酸的含量变化情况可以看出泡菜在第7 d左右发酵基本完成,泡菜可以食用。

2.7 泡菜样品中酸度及pH的测定结果

泡菜样品在发酵过程中酸度及pH的测定结果见表6。

表6 泡菜样品在发酵过程中酸度及pH的测定结果Table 6 Contents of total acidity and pH in kimchi during fermentation

由表6可知,泡菜酸度随着发酵时间的延长总体呈上升趋势,在最初3 d,泡菜酸度变化不大,第3～9 d上升较快,之后趋于稳定,这与闫雅岚等[21]的泡菜在自然发酵过程中营养成分变化规律的研究结果相似;pH随着发酵时间的延长总体呈下降趋势,第1 d变化较小,第1～7 d下降显著,第7 d后变化趋缓,这与杨瑞等[22]的泡菜发酵过程中主要化学成份变化规律的研究结果基本相似。

3 结论

本实验采用高效液相色谱法对甘蓝泡菜发酵过程中的有机酸成分进行快速定性定量分析,结果表明,随着发酵时间的延长,有机酸的种类及含量都在发生着变化:草酸含量一直最高,乳酸次之;从各有机酸的含量变化情况可看出泡菜在第7 d左右发酵基本完成,即可食用。该方法具有操作简单、快速、准确度高、精密度好的特点,适用于泡菜发酵过程中有机酸快速定性及其含量的测定。

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