厚皮甜瓜果实对链格孢侵染抵抗能力的差异

李 梦,冯作山,张明明,玛尔哈巴·帕尔哈提,王玉红,何 洋,白羽嘉

(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

新疆是我国厚皮甜瓜主产区,由于新疆高温炎热,甜瓜采收期集中,采后极易遭受病原菌侵染,烂损较为严重,给瓜农带来巨大经济损失,限制了新疆甜瓜产业的良性发展[1]。而病原菌是引起采后病害导致果蔬烂损的重要原因[2],其中链格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病是甜瓜储藏期间危害性最大的病害之一[34]。

新疆伽师瓜属晚熟厚皮甜瓜,肉厚质细、香甜清脆、含糖量高、果皮致密无网纹、耐贮运[5]。861甜瓜为中晚熟厚皮甜瓜,肉质松脆、呈橘红色、果皮富集网纹,贮藏性一般[6]。甜瓜果皮与果肉在结构、组织上有很大的区别。甜瓜果皮组织致密,富含果胶、纤维素和木质素等物质;果肉细脆,富含糖类、VC、胡萝卜素等营养物质。研究发现链格孢侵染水杨酸处理过的伽师瓜和861甜瓜第0～13 d,果实未出现明显病斑,但在侵染中后期,病斑迅速扩大,861甜瓜病斑大于伽师瓜[7]。伽师瓜和861甜瓜对病原菌侵染的抵抗能力存在差异,推测侵染前期果皮有效阻止了病原菌的侵染,中后期病原菌突破果皮的防御,果肉抵御能力较弱,病原菌在果肉中大量繁殖,病斑直径迅速扩大。

植物受到外界伤害时,是通过硬化细胞壁,产生抗菌化合物(植物抗毒素)和抗菌蛋白,通过加速细胞死亡,形成坏死病斑,启动体内一系列复杂的防御体系来抑制病原物的繁殖,进而保护自己[8]。植物抗病性机理主要涉及活性氧的产生、活化苯丙烷代谢途径、积累病程相关蛋白等[9]。几丁质酶和β1,3葡聚糖酶在植物抗病过程中存在相关性,具有降解真菌细胞壁的作用[10]。苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羟化酶、4香豆酸辅酶A连接酶是苯丙烷代谢途径中的关键酶系[11],其酶活性的提高是植物抗逆性增强的表现[12]。

本研究为了解甜瓜抗病性差异的原因,以伽师瓜和861甜瓜果实为实验材料,接种链格孢菌,测量贮藏期间果皮与果肉病斑大小,分析病程相关蛋白与苯丙烷代谢酶活性变化规律,比较甜瓜与甜瓜组织抵抗病原菌侵染的差异,为甜瓜采后病害的控制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

伽师瓜(卡拉克塞) 采摘于新疆喀什地区伽师县,选取可溶性固形物≥14%,单果重(3.5±0.5)kg,无病虫害、无机械损伤的果实;861甜瓜 采摘于新疆喀什地区伽师县,选取可溶性固形物≥15%,单果重(3.8±0.5)kg,无病虫害、无机械损伤的果实;链格孢菌(Alternariaalternata) 新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供,分离自伽师瓜自然发病的果实,PDA斜面保存；硼砂、硼酸、冰醋酸、无水醋酸钠、四硼酸钾、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚硫酸钠、甘油、氯化镁、抗坏血酸、EDTA 均为分析纯,天津市光复精细化工研究所;3,5二硝基水杨酸、结晶酚、β巯基乙醇、L苯丙氨酸、p香豆酸、辅酶A、二硫苏糖醇、亮抑酶肽、反式肉桂酸、几丁质、昆布多糖、蜗牛酶、ATP、PMSF、NADPNa2、G6pNa 生工生物工程(上海)股份有限公司。

FA2104N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;NBCJB型无菌操作台、MHP250型恒温培养箱 上海鸿都电子科技有限公司;LDZX50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;TGL16G型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;TU1810PC紫外可见分光光度计 北京普析通用公司;FE20型pH计 梅特勒托利多仪器有限公司;XSP2C型显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 损伤接种 链格孢菌接种于PDA培养基,28 ℃培养7 d,收集孢子。用含有0.01% Tween80的无菌水配制浓度为1×106个/mL孢子悬浮液。甜瓜果实用2%的过氧化氢清洗表面并浸泡30 s进行消毒,用清水冲洗干净后晾干,7 ℃预冷24 h。在甜瓜果实赤道等距刺孔6个(直径3.5 mm),深度为5 mm,接种20 μL的孢子悬浮液,对照组接入等量的无菌水。接种后,置于7 ℃、相对湿度85%～90%的冷库贮藏。

1.2.2 取样方法 分别于处理后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d在病斑周围5 mm处收集果皮和果肉组织,每次随机选取9个甜瓜进行取样,液氮速冻,80 ℃保存。

1.2.3 病斑直径的测量 在接种链格孢菌部位将甜瓜果实纵向剖开,测定甜瓜果皮与果肉过敏反应组织,每次测定6个瓜,计算平均值,即为病斑直径。

1.2.4 几丁质酶(CHT)活性的测定 参照曹建康[13]的方法,以每秒每克鲜重样品中酶分解胶状几丁质产生1×10-9mol N乙酰糖胺为一个几丁质酶活性单位(U),活性以U·s-1·g-1FW表示。

1.2.5β1,3葡聚糖酶(GLU)活性的测定 参照曹建康[13]的方法,以每秒每克鲜重样品中酶分解昆布多糖产生1×10-9mol葡萄糖为一个β1,3葡聚糖酶活性单位(U),活性以U·s-1·g-1FW表示。

1.2.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定 参照曹建康[13]的方法,以每小时每克鲜重果蔬组织反应吸光度增加0.01时为1个PAL活性单位(U),活性以U·h-1·g-1FW表示。

1.2.7 肉桂酸羟化酶(C4H)活性的测定 参照范存斐方法[12]并修改,粗酶液制备:取10 g冷冻果肉组织和5 g果皮组织,分别加入10 mL和20 mL提取液[50 mmol/L pH8.9 TrisHCl缓冲液,15 mmol/Lβ疏基乙醇,4 mmol/L氯化镁,5 mmol/L VC,10 μmol/L亮抑酶肽,1 mmol/L PMSF,0.15%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮,10%丙三醇],在冰浴条件下充分研磨后,于4 ℃、12000×g下离心20 min,收集上清液即为C4H粗酶提取液。反应体系:1.6 mL C4H粗酶提取液,4.4 mL缓冲液(2 μmol/L反式肉桂酸,50 mmol/L pH8.9 TrisHCl缓冲液,2 μmol/L NADPNa2,5 μmol/L G6-pNa)。立即在340 nm处比色。参比为不加酶提取液(加入1.6 mL蒸馏水)。以OD值每小时变化0.01为1个酶活性单位(U),酶活性单位为 U·h-1·g-1FW。样品重复测3次。

1.2.8 4香豆酸辅酶A连接酶(4CL)活性的测定 参照范存斐方法并修改[12],粗酶液制备:取10 g冷冻果肉组织和2 g果皮组织,分别加入10 mL和18 mL 0.2 mol/L TrisHCl缓冲液(含25%丙三醇、0.1 mol/L二硫苏糖醇、pH8.0)及少量石英砂,然后于4 ℃、12000×g条件离心20 min,收集上清液即为4CL粗酶提取液,并立即用于酶活测定。反应体系:1.8 mL 15 μmol/L Mg2+(硫酸镁或氯化镁),0.6 mL 5 μmol/mL p香豆酸,0.6 mL 50 μmol/mL ATP,0.6 mL 1 μmol/mL Co A以及2 mL酶液。40 ℃下反应10 min,在333 nm处测定吸光度值,以每分钟内OD333变化0.1为1个活性单位(U)。酶活性单位为U·min-1·g-1FW,对照不加香豆酸。样品重复测3次。

1.3 数据分析与作图

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行处理,Duncan’s多重比较进行差异显著性分析,Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 链格孢菌侵染甜瓜果实病斑直径的变化

甜瓜接种链格孢菌,每3 d测定病斑大小(图1)。链格孢菌侵染甜瓜第9 d,果皮与果肉出现病斑,并随贮藏时间延长呈不断扩大的趋势,果肉的病斑直径大于果皮;从第18 d开始,861甜瓜的病斑扩大速度大于伽师瓜;第30 d,伽师瓜和861甜瓜接种果肉的病斑直径分别是对应果皮的1.31倍和1.33倍(p<0.01),并且861甜瓜果皮与果肉病斑直径分别是伽师瓜的1.28倍和1.30倍(p<0.01)。

图1 链格孢菌侵染甜瓜果实病斑直径的变化Fig.1 Change in lesion diameter of muskmelon inoculated with A.alternata

2.2 链格孢菌侵染对甜瓜果实病程相关蛋白的影响

2.2.1 对甜瓜果实CHT活性的影响 CHT具有降解病原菌细胞壁,抑制抗病原侵染,抑制真菌生长的作用。病原菌的侵染可以增强植物CHT活性[14]。甜瓜接种链格孢菌期间,果皮与果肉的CHT活性随贮藏时间延长均呈先升高后下降的变化趋势,接种果实的CHT活性显著高于对照(p<0.05),果皮的CHT活性显著高于果肉(p<0.05)。链格孢菌侵染伽师瓜第21 d和第24 d,接种果皮和果肉的CHT活性分别达到峰值,果皮活性是果肉的2.33倍(p<0.01)(图2A);链格孢菌侵染861甜瓜同样是在第21 d和第24 d,接种果皮和果肉的CHT活性达到峰值,果皮活性是果肉的3.15倍(p<0.01)(图2B)。在贮藏期间,伽师瓜接种果皮与果肉的活性峰值分别是861甜瓜的1.29倍和1.74倍,差异极显著(p<0.01)。

图2 链格孢菌侵染对伽师瓜(A)和861甜瓜(B)CHT活性的影响Fig.2 Effects of A. alternata infection on CHT activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

2.2.2 对甜瓜果实GLU活性的影响 GLU具有破坏病原菌细胞壁,并从病原菌细胞壁中释放激发子诱导植株产生系统抗性的作用[10]。甜瓜接种链格孢菌期间,果皮与果肉的GLU活性随贮藏时间延长呈先升高后下降的变化趋势,接种果实的GLU活性均高于对照,果皮的CHT活性显著高于果肉(p<0.05)。链格孢菌侵染伽师瓜第18 d和第21 d,接种果皮和果肉的GLU活性分别达到峰值,果皮活性是果肉的1.85倍(p<0.01)(图3A);链格孢菌侵染861甜瓜第18 d,接种果皮和果肉的GLU活性达到峰值,果皮活性是果肉的2.08倍(p<0.01)(图3B)。伽师瓜接种果皮与果肉的活性峰值分别是861甜瓜的1.08和1.22倍,无显著差异。

图3 链格孢菌侵染对伽师瓜(A)和861甜瓜(B)GLU活性的影响Fig.3 Effects of A. alternata infection on GLU activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

2.3 链格孢菌侵染对甜瓜果实苯丙烷代谢酶活性的影响

2.3.1 对甜瓜果实PAL活性的影响 PAL是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶,参与了多种激发子诱导的抗性,增强了植物对病原物侵染的抵抗能力[15]。甜瓜接种链格孢菌期间,果皮与果肉的PAL活性随贮藏时间延长呈先升高后下降的变化趋势,接种果实的PAL活性均高于对照,果皮的PAL活性显著高于果肉(p<0.05)。链格孢菌侵染伽师瓜第21 d和第24 d,接种果肉和果皮的PAL活性分别达到峰值,果皮活性是果肉的2.35倍(p<0.01)(图4A);链格孢菌侵染861甜瓜第18 d和第21 d,接种果肉和果皮的PAL活性分别达到峰值,果皮活性是果肉的1.91倍(p<0.01)(图4B)。伽师瓜接种果皮的活性峰值是861甜瓜的1.48倍(p<0.01),接种果肉的活性峰值是861甜瓜的1.21倍,差异不显著。

图4 链格孢菌侵染对伽师瓜(A)和861甜瓜(B)PAL活性的影响Fig.4 Effects of A. alternata infection on PAL activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

2.3.2 对甜瓜果实C4H活性的影响 C4H与果实体内咖啡酸和阿魏酸等物质的合成前体p香豆酸的合成密切相关,这些酚酸可直接毒杀病原物,对病原菌的生长繁殖产生抑制[1617]。甜瓜接种链格孢菌期间,果皮与果肉的C4H活性随贮藏时间延长呈先升高后下降的变化趋势,接种果实的C4H活性显著高于对照(p<0.05),果皮的C4H活性显著高于果肉(p<0.05)。链格孢菌侵染伽师瓜第24 d,接种果皮与果肉的C4H活性均达到峰值,果皮活性是果肉的1.59倍(p<0.01)(图5A);链格孢菌侵染861甜瓜第21 d,接种果皮与果肉的C4H活性达到峰值,果皮活性是果肉的1.64倍(p<0.01)(图5B)。伽师瓜接种果皮与果肉的活性峰值分别是861甜瓜的1.34倍和1.38倍,差异极显著(p<0.01)。

2.3.3 对甜瓜果实4CL活性的影响 4CL是控制苯丙烷主途径向分支途径转折的关键酶,在植物与外界环境互作过程中发挥重要作用[15]。甜瓜接种链格孢菌期间,果皮与果肉的4CL活性随贮藏时间延长呈先升高后下降的趋势,接种果实的4CL活性显著高于对照(p<0.05),果皮的4CL活性显著高于果肉(p<0.05)。链格孢菌侵染伽师瓜第21 d和第24 d,接种果皮与果肉的4CL活性分别达到峰值,果皮活性是果肉的2.43倍(p<0.01)(图6A);链格孢菌侵染861甜瓜同样是第21 d和24 d,接种果皮和果肉的4CL活性达到峰值,果皮活性是果肉的1.79倍(p<0.01)(图6B)。伽师瓜接种组果皮与果肉4CL活性峰值分别是861甜瓜的1.87和1.38倍,差异极显著(p<0.01)。

图6 链格孢菌侵染对伽师瓜(A)和861甜瓜(B)4CL活性的影响Fig.6 Effects of A. alternata infection on 4CL activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

3 讨论

当病原菌入侵时植物能够非常有效地激活自身产生防御反应,其防御体系是一个多因素相互作用的复杂体系,包括各种防御酶和抗病物质等[1820]。伽师瓜和861甜瓜受到链格孢菌侵染后,在贮藏第9 d出现病斑,9～30 d病斑直径不断扩大,其中861甜瓜病斑直径大于伽师瓜,果肉的病斑直径大于果皮,是由于伽师瓜果皮与果肉中的防御酶和抗病物质含量高于861甜瓜。

链格孢菌侵染后,甜瓜CHT、GLU活性均高于对照,并呈先升高后降低的变化趋势,原因在于链格孢菌侵染甜瓜前期,诱导甜瓜CHT和GLU的产生和积累,增高了甜瓜CHT和GLU活性[10];伽师瓜果皮与果肉在抵抗链格孢菌侵染高峰时期的酶活性均高于861甜瓜,甜瓜果皮的酶活性均显著高于果肉,是由于伽师瓜果实中CHT和GLU含量的积累高于861甜瓜且两种甜瓜果皮中的含量高于果肉;贮藏后期CHT和GLU活性降低,原因是链格孢菌侵染突破了甜瓜果皮与果肉的防线。

链格孢菌侵染后,甜瓜PAL、C4H、4CL酶活性均高于对照,并呈先升高后降低的变化趋势,伽师瓜果皮与果肉在抵抗链格孢菌侵染高峰时期的酶活性均高于861甜瓜,甜瓜果皮的酶活性均显著高于果肉,原因在于链格孢菌侵染后,激活了甜瓜果实体内苯丙烷代谢,引起PAL、C4H和4CL活性提高[21]。PAL参与多种激发子诱导的抗性,增强植物对病原菌侵染的抵抗能力[15,22];C4H活性的增强有利于果实体内酚酸物质的合成,这些酚酸可直接毒杀病原物,对病原菌的生长繁殖产生抑制[1617];4CL代谢产物的积累具有抵抗病原物侵染、增强果实表皮结构,提高植物抗病性的作用[15]。

病程相关蛋白和苯丙烷代谢酶活性与植物抗病性密切相关,一般认为植物体内酶活性与抗病性呈正相关[2324]。伽师瓜抗病酶活性高于861甜瓜,果皮酶活性高于果肉,说明了伽师瓜抗病性高于861甜瓜,果皮抗病性强于果肉。

4 结论

伽师瓜和861甜瓜接种链格孢菌,贮藏期间861甜瓜病斑直径大于伽师瓜,甜瓜果肉病斑直径显著大于果皮。两种甜瓜果实通过增高CHT和GLU及PAL、C4H、4CL活性来抵御链格孢菌的侵染,接种伽师瓜的病程相关蛋白与苯丙烷代谢酶活性峰值均高于861甜瓜,接种甜瓜果皮的酶活性显著高于果肉。伽师瓜的抗病能力强于861甜瓜,果皮的抗病能力强于果肉。

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