土家药食资源藤茶提取物体外抗氧化活性研究

徐 新，李佳川，王 元，龙 怡

(1.西南民族大学药学院，四川 成都 610041；2.成都中医药大学附属医院针灸学校，四川 成都 610075)

藤茶[1-3]是湖南武陵山区土家族常用的药食保健资源，也是四川、湖北、贵州等地的彝族、苗族[4-5]少数民族习用饮品，具有悠久的应用历史、较高的营养成分和医药保健价值，开发价值很大.现代研究表明，藤茶富含丰富的多糖类、黄酮类以及多酚类化合物[6]，具有抗炎[7]、抗肿瘤[8]、降血糖[9]、调血脂[10-11]等多种药理活性.近年来，随着生活水平的提高，心脑血管疾病、代谢性疾病已成为严重危害人类健康的重大疾病，早期防治临床意义显著.诸多研究提示，氧化应激损伤是诸多心脑血管疾病、代谢性疾病发生的共同病理生理基础，这些疾病的发生与机体“过量”的氧化应激发生呈正相关.因此，本研究以武陵山区土家族常用的道地药食资源藤茶为研究对象，在中医药及民族医药理论的指导下，分别建立DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、超氧阴离子清除法、总抗氧化能力测定法共4种体外抗氧化模型，系统观察藤茶的体外抗氧化保健活性，以期为藤茶的合理使用和为进一步保健产品开发提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 药物

野生藤茶，产地湖南省张家界，经西南民族大学顾健教授鉴定为显齿蛇葡萄科Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)W.T.wang的干燥嫩茎叶.采用水煎煮提取制备成1 g(原药材)/mL浓度药液，-20℃保存备用.抗坏血酸(Vc)，北京百灵威科技有限公司，批号:LDC0Q76.

1.2 试剂

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，sigma，批号:D9132；水杨酸，镇江前进化工有限公司，批号:DS0122；抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基试剂盒和总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为20170328和20170329.

1.3 仪器

Multiskan Spectrum全波长酶标仪，Thermo Scientific；722N可见分光光度计，上海莱帕德科学仪器有限公司.

1.4 方法

1.4.1 DPPH自由基的清除率测定

参考Kumaran等[12]方法并稍作修改，分别精密吸取藤茶供试品溶液，置5 mL离心管中，加入无水乙醇补足至2 mL，摇匀.加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液溶液，摇匀，避光放置30 min，离心，取上清液于517 nm下测定吸光度值，每组平行测定三次，取平均值计算清除率，公式如下:

(式中A0为DPPH乙醇溶液的吸光度值，As为样品溶液的吸光度值)

1.4.2 对羟基自由基的清除率的测定

参考彭金龙等[13]和苏秀兰[14]等方法并稍作修改，分别精密吸取1 mL藤茶供试品溶液，置5 mL离心管中，在离心管中分别加入1 mL 9 mmol/L的Fe-SO4溶液和1 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，加入1 mL 30%H2O2启动反应，放入37℃水浴锅恒温反应30 min，用待测液空白对照管作为空白对照，以Vc作为阳性对照.蒸馏水调零，用分光光度计测定波长为510 nm处的吸光度.每组平行测量三次，取均值.清除率公式如下:

(A1:被测液的吸光度；A0:被测液的空白对照；A2:水杨酸的空白对照)

1.4.3 超氧阴离子自由基(O2-·)清除法率的测定

依据预实验结果制备藤茶相应浓度供试品溶液，按照抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基试剂盒的要求，分别检测藤茶对超氧阴离子自由基的影响.

1.4.4 总抗氧化能力的测定

依据预实验结果制备藤茶相应浓度供试品溶液，按照总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒的要求，制备FeSO4-7H2O标准品，以标准品OD值为横坐标，各OD值对应的标准品浓度为纵坐标制成标准曲线，得曲线公式，把样本测定管测得的OD值代入计算公式，求得藤茶的总抗氧化能力.

1.5 数据统计

实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，并计算相关数据的IC50值.

2 结果与分析

2.1 藤茶对DPPH自由基的清除作用

DPPH作为一种稳定的有机自由基试剂，常被用作体外测定药物的抗氧化活性筛选使用.本实验研究结果如表1和图1，随着藤茶浓度的增加，藤茶对DPPH自由基的清除作用呈浓度依赖性的增加，其IC50值为 33.805 μg/mL，当浓度达到 190.6 μg/mL时，清除率达到90%以上.

表1 藤茶对DPPH自由基的清除作用(±s)Table 1 Scavenging effect of Vine tea on DPPH radical(±s)

表1 藤茶对DPPH自由基的清除作用(±s)Table 1 Scavenging effect of Vine tea on DPPH radical(±s)

组别 浓度(μg/mL) 样本数(n) 清除率(%)藤茶提取物 238.3 3 91.3±2.4 190.6 3 90.9±2.3 152.5 3 89.5±3.1 122.0 3 87.4±2.1 97.6 3 83.7±2.2 78.1 3 79.1±2.5 62.5 3 72.3±2.1 50.0 3 65.2±1.5 40.0 3 55.3±1.6 32.0 3 46.1±1.1 25.6 3 39.1±1.2 20.5 3 32.1±1.8抗坏血酸 50.0 3 88.4±2.6 40.0 3 85.9±2.4 32.0 3 80.7±1.9 25.6 3 74.6±2.1 20.5 3 65.2±1.7

图1 藤茶提取物清除DPPH自由基浓度-清除率曲线(量效关系)Fig 1 The concentration-clearance rate curve of Vine tea extractive’s scavenging on DPPH radical(dose-effect relationship)

2.2 藤茶对羟基自由基的清除作用

羟基自由基的清除率是反应药物抗氧化活性的临床应用重要指标，羟基自由基能与体内多种物质相互作用，导致细胞氧化损伤.本实验研究结果如表2和图2所示，藤茶在1.6～200 mg/mL范围内，对羟基自由基的消除率呈浓度依赖性的增加，其IC50值为18.713 mg/mL，当浓度达到150 mg/mL时，清除率达到90%以上.

表2 藤茶对羟基自由基的清除作用(±s)Table 2 Scavenging effect of vine tea on hydroxyl radicals(±s)

表2 藤茶对羟基自由基的清除作用(±s)Table 2 Scavenging effect of vine tea on hydroxyl radicals(±s)

组别 浓度(mg/mL) 样本数(n) 清除率(%)藤茶提取物 200.0 3 95.5±3.2 150.0 3 91.7±2.4 100.0 3 86.7±2.6 80.0 3 81.4±2.2 50.0 3 73.1±1.8 25.0 3 56.3±1.7 12.5 3 37.5±1.2 6.3 3 22.2±0.9 3.2 3 13.5±1.2 1.6 3 8.8±0.8抗坏血酸 6.3 3 86.7±3.1 3.2 3 84.4±2.5 1.6 3 75.6±1.7 0.78 3 58.0±1.4 0.39 3 29.0±1.1

图2 藤茶提取物清除羟基自由基浓度-清除率曲线(量效关系)Fig 2 The concentration-clearance rate curve of Vine tea extractive’s scavenging on hydroxyl radicals(dose-effect relationship)

2.3 藤茶对超氧阴离子自由基的清除作用

超氧阴离子是活性氧的一种，过量会对机体造成严重损害.本实验研究结果如表3和图3，藤茶显示出较好的抗超氧阴离子自由基的作用.药物在1.6～200 mg/mL范围内，抗超氧阴离子自由基的活力值呈浓度依赖性的增加，当藤茶浓度达到200 mg/mL时，其活力值最高可达到263.1U/L.

表3 藤茶对超氧阴离子的清除作用(x-±s)Table 3 The scavenging effect of Vine tea on superoxide anion(x-±s)

图3 藤茶清除超氧阴离子自由基浓度-活力值曲线(量效关系)Fig 3 The concentration-vitality value curve of Vine tea’s scavenging on superoxide anion radicals(dose-effect relationship)

2.4 藤茶总抗氧化能力(FRAP法)的测定

以FeSO4·7H2O标准品 OD值为横坐标，各 OD值对应的标准品浓度为纵坐标制成标准曲线，如图4所示，用作图软件制得曲线公式为 y＝4.9958x-0.5785(R2＝0.999).将各浓度藤茶的测定OD值带入曲线公式，即得表4，实验研究结果如图5所示，藤茶在0.195～6.30 mg/mL的浓度内，总抗氧化能力变化幅度较小，但随着剂量的增加，在12.50～50.00 mg/mL浓度范围内，药物总抗氧化能力呈浓度依赖性的增加，最高值达到19.764 mM.

图4 总抗氧化能力测定标准曲线Fig 4 The standard curve of total antioxidant capacity

表4 藤茶对总抗氧化能力的影响(x-±s)Table 4 Effect of vine tea on total antioxidant capacity(x-±s)

图5 藤茶浓度-总抗氧化能力曲线(量效关系)Fig 5 The concentration-total antioxidant capacity curve of Vine tea(dose-effect relationship)

3 讨论与结论

活性氧与自由基损伤对人体健康的影响深刻而广泛，生物机体正常代谢过程中会产生超氧阴离子、羟基自由基等多种活性氧自由基，这些过多的自由基是造成机体组织病理性损伤的病理基础.在正常情况下，机体的自由基处于正常的动态平衡，机体产生的过多自由基会迅速被体内的清除剂所清除.但当机体的抗氧化防御体系受到损伤时，人体各系统的代谢发生紊乱，从而引发机体心脑血管疾病、代谢性疾病甚至肿瘤等一系列疾病的发生[15].尤其随着生活水平的提高，长期的高血糖、高血脂的作用，加剧造成这一系列病理性的“过氧化”，通过氧化应激加速损伤血管内皮细胞，导致血管内皮舒缩功能障碍或异常，导致血管壁动脉粥样硬化版块形成，从而加剧了冠心病、心肌梗死及脑血栓、脑出血等心脑血管突发事件的发生.

藤茶是湖南武陵山区土家族常用保健饮品，药食资源道地，开发价值很大.深入开展民族地区特色药食资源保健产品开发，对发挥中医药及民族医药“药食同源”的保健特色优势，促进民族地区特色食药资源的可持续发展具有很大的意义；同时，将民族地区特色药食资源优势转化为具有自主知识产权的特色产品，可为民族地区实现可观的经济效益和良好的社会效益.

本实验研究结果表明，藤茶提取物对DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基均显示出明显的清除或抑制作用，总抗氧化能力明显增加，且上述作用均呈一定的剂量依赖性.其中药物对DPPH清除作用的IC50值为0.338 mg/mL，对羟基自由基清除作用的IC50值为18.713 mg/mL，对超氧阴离子抑制的最大活性值高达263.1 U/L，总抗氧化能力也达到19.764 mM.上述结果从不同抗氧化机制途径方面证实了藤茶具有确切的体外抗氧化作用，值得进一步研究开发.

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