佛手柑内酯抑制p62/NF-κB信号轴增强顺铂对肝癌杀伤的影响

郑志明，邹海鹏，卢敏娟，林碧华，周克元

肝癌主要是临床上最常见的恶性肿瘤之一[1]。2012年统计显示，中国肝癌发生的病例数为394 770(占总癌症发生病例的12.9%)，死亡病例数为383 203(占总癌症死亡病例的17.4%)[2]，显示出我国肝癌防治形势的严峻。由于肝癌起病隐匿，进展迅速，患者确诊时往往已有肝内转移甚至肝外远处转移的发生[3]，因此，化疗在肝癌治疗中起着重要作用。常用的肝癌的化疗药有顺铂、阿霉素、丝裂霉素和氟尿嘧啶等，但肝癌是化疗药物敏感性较低，且极易产生耐药性，对肝癌患者的生存预后受益有限[4]。因此，揭示肝癌耐药的分子机制并从中寻找到逆转的方法，成为了近年来肝癌研究的热点。在此，该文将观察中药有效成分佛手柑内酯在低浓度下对肝癌细胞顺铂诱导凋亡的影响，并着重分析佛手柑内酯对p62/NF-κB信号轴的影响。

1 材料与方法

1.1关键试剂及仪器RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液及TRIzol购自美国Invitrogen公司；二甲基乙砜(DMSO, D119415)、佛手柑内酯(M101153)、Hoechst33258染料(B113844)及普通化学试剂购自上海阿拉丁试剂公司；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所；p62鼠单抗(66184-1-Ig)、p65兔多抗(10745-1-AP)、α-Tubulin(66031-1-lg)鼠单抗购自美国Proteintech公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗购自美国Merck公司；PVDF膜、ECL发光液购自美国Millipore公司； Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液、5×蛋白上样缓冲液、pNF-κB-TA-luc质粒、pGL6-TA-luc质粒、pRL-SV40-C质粒及双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物研究所；反转录试剂盒及SYBR Green定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司；实时定量PCR仪为CFX96、垂直电泳系统、槽式转膜系统及冷凝CCD成像系统购自美国Bio-Rad公司；多功能酶标仪为Synergy2购自美国BioTek公司；流式细胞分析仪为FACSCanto II购自美国BD公司。

1.2细胞传代培养及分组人肝细胞癌细胞HepG2和Bel-7402为广东医学院生物化学与分子生物学教研室长期传代培养及规范冻存。HepG2和Bel-7402的培养条件为，含10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI-1640培养基，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。根据预实验，确定1 μmol/L顺铂对两肝癌细胞的48 h抑制率<50%，1 μmol/L佛手柑内酯对两肝癌细胞的48 h抑制率<10%，上述两浓度可以用于观察佛手柑内酯对顺铂的增敏作用。因此，实验组分三组，单用1 μmol/L顺铂(顺铂组)，单用1 μmol/L佛手柑内酯(佛手柑内酯组)，1 μmol/L顺铂与1 μmol/L佛手柑内酯联用处理(联合组)，对照组为1% DMSO处理，各组处理时间均为48 h。

1.3CCK-8测定细胞活性参考文献[5]，将细胞接种于96孔培养板中，加入终浓度分别在0.1 μmol/L～1 mmol/L间的含顺铂或佛手柑内酯培养液正常培养48 h，当培养时间结束时，弃去原培养液，每孔加入含10 % CCK-8的培养液，5% CO2、37 ℃孵育2 h，酶标仪检测各孔吸光度，扣除背景值后以未加药孔为基准求算各药物浓度的抑制率，利用两点法求算半数抑制浓度。

1.4凋亡核形态计数分析参考文献[6]，按实验分组处理后，弃除培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞，加入0.5 mg/L Hoechest 33258染液避光染色20 min，利用倒置荧光显微镜观察拍照，每组细胞在200×视野中随机选取5个视野，计数典型的凋亡细胞形态：荧光增强，细胞核缩小碎裂，呈大小不等的圆形、花瓣状或不规则块状。

1.5AnnexinV-FITC/PI凋亡率检测参考文献[5]，按实验分组处理后，胰酶消化细胞后收集，根据试剂盒提供的说明书操作：离心弃上清液并用PBS洗涤细胞1次，同前弃尽上清液后，按每1×105细胞加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞后，加入5 μl Annexin V-FITC混匀室温避光孵育10 min。离心弃上清液后，加入190 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入10 μl PI染液混匀后冰浴。随即进行流式细胞分析仪检测，调整并收集每个样品的前散射光、侧散射光、Annexin V-FITC和PI四个通道的信号，并以前散射光/侧散射光作散点图圈出主细胞群，再以Annexin V-FITC/PI对主细胞群作图分出Annexin V-FITC阳性、红光阴性或阳性的凋亡细胞群，得到每组细胞的凋亡率。

1.6荧光定量PCR检测参考文献[5]，按实验分组处理后，弃去原培养基，PBS洗2次，加入TRIzol室温裂解，氯仿抽提，离心后吸取上清液至新离心管中，加入异丙11醇沉淀RNA，用含75%乙醇的DEPC水溶洗涤RNA沉淀3次，用DEPC水溶解RNA。测得浓度后按PrimeScript RT reagent Kit说明书操作，进行反转录；按SYBR Premix Ex Taq II Kit说明书操作(引物信息见表1)，在CFX96实时定量PCR系统上，选用2-ΔΔCT相对定量法进行检测分析，其中选用GAPHD为内参基因，求算各目标基因的相对mRNA表达量。

表1 荧光定量PCR检测所用引物

1.7荧光素酶报告基因活性检测参考文献[6]，将细胞接种于24孔板中，24 h后换入Opti-MEN培养液。按10 ∶1分别混合pNF-κB-TA-luc或pGL6-TA-luc与pRL-SV40-C，并用Lipofectamine 2000包装后转染细胞。正常培养6 h后，按实验分组替换为含药完全培养液，继续培48 h。去除培养液，PBS洗涤，加入裂解液充分裂解细胞后，离心取上清液转于96孔板，利用Synergy2多功能酶标仪的自动加样装置，按检测顺序自动加入萤火虫荧光素酶检测试剂和肾荧光素酶检测试剂，并以空白孔为参照测定每孔的相对荧光信号，按下列公式计算相对实验组的相对荧光强度：

1.8Westernblot检测参考文献[5]，按实验分组处理后，弃去原培养基，PBS洗2次，加入RIPA裂解液冰上裂解，离心收集上清液，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，向上清液加入5×上样缓冲液，沸水浴变性蛋白。使用SDS-PAGE蛋白电泳系统，上样量为50 μg总蛋白，电泳参数为10%分离胶、5%浓缩胶，100 V电泳至溴酚蓝指示剂迁移至底部后，进行电转移，使用0.2 μm的PVDF膜，300 mA冰浴电转90 min。电转结束后，膜使用5%脱脂奶粉封闭，TBST漂洗后，加入稀释的一抗工作液(按产品说明书稀释配制)，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后，加入稀释的二抗工作液(按产品说明书稀释配制)，室温孵育1 h，TBST漂洗后，加入ECL发光液，置压片夹中用X光片感光，经显影定影后，得到相应的Western blot结果。

2 结果

2.1佛手柑内酯对肝癌细胞的活性抑制利用梯度佛手柑内酯处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，利用两点法求算半数抑制浓度分别为(194.0 ± 146.7) μmol/L和(331.7 ± 209.7) μmol/L。此外，利用1 μmol/L顺铂处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，两细胞的抑制率分别为(69.0±1.5)%和(71.3±1.4)%，均高于90%；利用1 μmol/L佛手柑内酯处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，两细胞的抑制率分别为(93.4±1.6)%和(94.7±1.0)%，均高于90%，故后续实验中顺铂与佛手柑内酯的浓度均选用1 μmol/L。

2.2佛手柑内酯对肝癌细胞凋亡核形态的影响按实验分组处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，如图1所示，相对于对照组，顺铂组和佛手柑内酯组均能诱导肝癌细胞出现凋亡核形态，但顺铂组凋亡核形态明显多于佛手柑内酯组(P<0.05)；联合组中两肝癌细胞的凋亡核形态比顺铂组分别增加1.99倍和2.00倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3佛手柑内酯对凋亡细胞群的影响按实验分组处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，如图2所示，相对于对照组，佛手柑内酯组和顺铂组中均有肝癌细胞出现凋亡，但顺铂组凋亡明显多于佛手柑内酯组(P<0.05)；联合组中两肝癌细胞的凋亡细胞群比例比顺铂组分别增加1.86倍和2.00倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4佛手柑内酯对抗凋亡相关基因表达的影响按实验分组处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，如图3所示，相对于对照组，佛手柑内酯组和顺铂组中，BCL2、BCL2L1、XIAP和BIRC5均不同程度地降低，不同药物对不同基因的诱导降低效果不一；联合组中两肝癌细胞的抗凋亡相关基因的下调较佛手柑内酯组或顺铂组均更为显著，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5佛手柑内酯对NF-κB转录活性的影响按实验分组处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，如表2所示，相对于对照组，佛手柑内酯组与顺铂组中，肝癌细胞NF-κB转录活性降低，且佛手柑内酯组NF-κB转录活性较顺铂组更低(P<0.05)；联用组中两肝癌细胞NF-κB转录活性仅为顺铂组的0.28倍和0.25倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 佛手柑内酯对肝癌细胞凋亡核形态的影响 ×100

图2 佛手柑内酯对凋亡细胞群的影响

图3 佛手柑内酯对抗凋亡相关基因表达的影响

A：HepG2细胞：B：Bel-7402细胞；1：对照组；2：佛手柑内酯组；3：顺铂组；4：联用组；与对照组比较：*P<0.05；与顺铂组比较：#P<0.05

表2 佛手柑内酯对NF-κB转录活性的影响(n=3，±s)

与对照组比较：*P<0.05；与顺铂组比较：#P<0.05

2.6佛手柑内酯对p62及p65蛋白表达的影响按实验分组处理肝癌HepG2和Bel-7402细胞48 h后，如图4所示，相对于对照组，佛手柑内酯组和顺铂组中，p62及p65蛋白表达水平下调；联合组肝癌细胞中p62及p65蛋白的表达水平降低更为显著。

图4 佛手柑内酯对p62及p65蛋白表达的影响

3 讨论

佛手柑内酯属于呋喃型香豆素类天然产物，为多种植物的次级代谢物，更是中药佛手[7]和当归[8]等的主要有效成分之一，具有抗炎、平喘、镇静及催眠等药理作用[9]。最近的研究显示，佛手柑内酯对多种恶性肿瘤具有显著的抑制作用，如乳腺癌[10]及白血病[9]等。本课题组的前期研究[11]也显示，佛手柑内酯对鼻咽癌细胞具有抑制增殖并诱导凋亡的作用，表明佛手柑内酯具有一定的抗肿瘤活性，然而佛手柑内酯对肿瘤细胞的有效抑制浓度较高，不宜作为单独的抗肿瘤药物开发。在此，本研究利用低浓度(1 nmol/L)的佛手柑内酯与1 nmol/L顺铂联用处理肝癌细胞，显示其能显著增强顺铂对肝癌细胞的杀伤能力，暗示了低浓度佛手柑内酯可以作为化疗药物增敏剂的作用。

大量的研究[12]证实，炎症相关的NF-κB在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤组织及细胞中表达上调并维持异常激活状态，参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、复发和抗肿瘤治疗耐受等密切相关。静息状态时，NF-κB二聚体(p50，p65)与细胞质的抑制因子IκBα结合，以无活性的状态存在于细胞质中；当细胞内外的各种信号通过级联传导，使IκB激酶磷酸化IκBα导致IκBα降解而NF-κB恢复活性的游离状态，激活的NF-κB入核与DNA结合，促进下游靶基因转录[13]。在肿瘤细胞抗化疗的机制中，癌细胞能通过持续激活的NF-κB，上调抗凋亡因子如BCL2、BCL2L2、XIAP和BIRC5等的过量表达，发挥促存活作用[12]。本研究显示，低浓度(1 nmol/L)的佛手柑内酯与1 nmol/L顺铂联用处理肝癌细胞，能显著抑制NF-κB的转录活性，并降低细胞中BCL2、BCL2L2、XIAP和BIRC5等的表达，表明了低浓度的佛手柑内酯是通过抑制NF-κB的转录活性，降低了抵抗凋亡的多个基因表达水平，从而增强顺铂的杀伤作用。

研究[14]显示，在肝癌组织与细胞中，NF-κB的持续性激活可能与多功能蛋白p62的异常高表达相关，敲除p62显著抑制NF-κB的激活。p62是一种多功能泛素结合蛋白，在细胞信号转导中起支架和适配的作用，p62分子结构中的多个功能结构域可与其它蛋白质相互作用，参与泛素蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统两种蛋白降解过程[15]。研究[15]显示p62调控NF-κB主要方式，是通过TB结构域结合TRAF，形成p62-TRAF6-IKKβ-aPKC 的信号复合物激活NF-κB通路；在此通路中，p62与MAPK激酶激酶前端基本区域MEKK3结合作为活动中心募集TRAF6及其他聚合物，进一步促进TRAF6的寡聚化及泛素化，最终诱导NF-κB的激活。本研究显示，低浓度(1 nmol/L)的佛手柑内酯与1 nmol/L顺铂联用处理肝癌细胞，能显著抑制p62蛋白的表达水平，这可能是NF-κB表达及转录活性受抑制的可能机制。后续的研究中将进一步通过实验揭示，佛手柑内酯下调p62的具体机制，并通过裸鼠模型，进一步探讨低浓度佛手柑内酯作为化疗药物增敏剂的可能性。

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