6种葡萄风信子倍性鉴定

孔令月，李冬梅，刘雅莉

(西北农林科技大学 风景园林与艺术学院，陕西 杨陵 712100)

葡萄风信子是一种以蓝色著称的香花植物，为天门冬科葡萄风信子属(Muscari)，是一种原产于东地中海的希腊、土耳其至高加索地区多年生球根花卉，并且其抗寒、抗旱性和复花性良好[1-3]，被广泛应用于地被，花境、草坪镶边，或家庭盆栽。

自然界中的多倍体植物极为常见，大部分被子植物都经历了多倍化事件[4]，这使基因出现多样化突变，除继承原本功能外，还可能出现功能的丧失、分化，甚至进化出新的功能。基因复制和随后的基因功能差异促进植物的适应性进化[5]。因此，植物倍性对研究植物基因功能、遗传育种等方面都具有巨大指导意义。

关于葡萄风信子倍性的研究在1968年就已出现，早期大部分研究表明，葡萄风信子属的染色体基本数目是x=9[6-8]。Johnson等通过标准根尖压片法方法调查多个土耳其地区葡萄风信子样本发现，M.neglectum染色体数目有2n=18,36,54，M.armeniacum2n=18,18+2B,36;M.aucheri2n=18,36[8-10]。另有文献发现M.neglectum八倍体外观正常，与邻近的四倍体、六倍体大小并无显著差异[11]。葡萄风信子某些品种的染色体数目至今存在争议，这就为后期研究基因功能、杂交育种造成了极大的困难。

本试验以葡萄风信子亚美尼亚、蔚蓝、‘海洋的魔法’、‘黑眼睛’、‘白色丽人’、‘日出’为材料，利用流式细胞仪对6种葡萄风信子进行倍性分析，为后期葡萄风信子的品种选育工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为葡萄风信子亚美尼亚M.armeniacum，‘海洋的魔法’M.aucheri‘Ocean Magic’，‘黑眼睛’M.armeniacum‘Dark Eyes’，葡萄风信子蔚蓝M.azureum，‘白色丽人’M.aucheri‘White beauty’和‘日出’M.‘Pink Surprise’。所有种球购于浙江虹越花卉股份有限公司并种植于西北农林科技大学试验田(34°14′53.27″N，108°03′10.85″E)。第2年种球萌发后取新鲜根尖和叶片用于后续试验。

1.2 试验方法

1.2.1 常规压片法鉴定葡萄风信子倍性 随机选取6株葡萄风信子‘蔚蓝’，通过常规压片法进行染色体计数。参考戴小红[12]等百合根尖处理方法，在温暖的晴天取分裂旺盛的根尖材料，以0.002 M的8-羟基喹啉溶液室温(20±4)℃下处理3～5 h，蒸馏水冲洗2次后转入卡诺氏固定液(V无水乙醇∶V冰醋酸=3∶1)中固定6 h，用95%酒精洗去冰醋酸，最后将材料保存于70%酒精中。制片时将固定后的材料取出，用60℃预热的1 mol/L盐酸解离8～10 min，改良卡宝品红溶液染色5 min，压片法制片，OLYMPUS BX51研究级正置荧光显微镜下观察拍照。

1.2.2 流式细胞仪分析倍性 参照Jaroslav Dolezel[13]等的方法，在培养皿中加1 mL预冷的Tris.MgCl2buffer(200 mmol·L-1Tris,4 mmol·L-1MgCl2·6H2O,0.5% (v/v) TritonX-100用1 N HCl调节pH值至7.5)，取待测葡萄风信子新鲜叶片约50 mg放入培养皿，以锋利刀片迅速切碎，晃动几下混合均匀，用42 μm尼龙网过滤液体，最后同时加入Propidium Iodide (PI) 染料(50 μg/mL)和RNase (50 μg/mL)，冰上孵育30 min。样品使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测。用FlowJo VX软件处理数据。

2 结果与分析

2.1 常规压片法鉴定葡萄风信子倍性

对葡萄风信子进行压片分析，显微镜观察发现葡萄风信子蔚蓝可以观察到成对的细胞分裂中期染色体，为二倍体，2n=2x=18(图1)。

注：A：葡萄风信子蔚蓝分裂中期染色体；B：葡萄风信子蔚蓝核型。

图1葡萄风信子蔚蓝中期染色体及核型

Fig.1 The metaphase chromosome and chromosome karyotype ofM.azureum

2.2 流式细胞仪检测葡萄风信子倍性

后续以二倍体葡萄风信子蔚蓝为外标，利用流式细胞仪对5种葡萄风信子倍性进行鉴定，根据G1时期峰平均荧光强度计算可知相对DNA含量(图2)。结果显示，除蔚蓝外，还有‘黑眼睛’、‘日出’为二倍体，‘白色丽人’、‘海洋的魔法’为三倍体，葡萄风信子亚美尼亚为四倍体。

3 结论与讨论

本研究首次鉴定了葡萄风信子蔚蓝、‘黑眼睛’、‘日出’、‘白色丽人’和‘海洋的魔法’的倍性。传统根尖压片法分析植物核型工作量大、耗费时间长[14]，前期镜检6种葡萄风信子根尖，很难得到清晰可分离的染色体分裂中期细胞(数据未显示)。对于研究生物进化、分类来说，研究多采用核型分析[15-16]，但对于仅分析染色体数目，采用已知倍性的材料做参照，利用流式细胞仪检测更方便快捷。由于目前尚未出现植物通用的细胞核缓冲液，检测不同植物或者不同组织只能通过试验选择合适的试剂，植物组织中的多糖、多酚或其他代谢产物都会对检测产生影响[17-18]，而葡萄风信子是一种富含多糖的植物[19]，流式细胞数据显示有部分细胞的荧光强度结果出现在坐标轴以外，可能是多糖物质影响了缓冲液，切割不完全，使多个细胞粘连所致。

倍性不明确一直是葡萄风信子育种中的重要障碍。对于葡萄风信子属植物来说，种内倍性变化并不罕见，特别是M.armeniacum和M.neglectum。早期Stuart[18]研究发现二者染色体数均为2n=18。而Dalgic[9]认为M.neglectum不同个体可能是2n=28,45,54。T.KARLEN[11]研究了M.neglectum希腊地区81个种群，其中32个为2n=18，22个2n=36，22个2n=54，1个2n=72，并且八倍体植株外观正常，大小也与四倍体和六倍体并无差别。Johnson[10]对土耳其地区的葡萄风信子属野生种群核型分析发现，M.armeniacum有2n=18，18+2B，18+0-3B，36，M.neglectum也出现2n=18，36。A.Jafari[20]等对M.neglectum研究发现，采自伊朗东南的M.neglectum样本，还有2x=2n-1=54，2x=2n+3=48等情况出现。

注：A：蔚蓝；B：‘黑眼睛’；C：‘日出’；D：‘白色丽人’；E：‘海洋的魔法’；F ：亚美尼亚。

但对比葡萄风信子属上述2个品种，M.botryoides的倍性分布似乎有一定地域规律。Lajos Somlyay 等人对从匈牙利(25个地区)和罗马尼亚(1个地区)采集的葡萄风信子样本进行核型分析，发现罗马尼亚采集的样本(M.transsilvanicum)为二倍体(2n=18)，匈牙利地区的样本(M.botryoides)二倍体和四倍体均有出现，所有二倍体样本均具有相似核型，且从核型观察，四倍体似乎就是二倍体的加倍。从地理分布上看，匈牙利地区二倍体和四倍体分别占据着非重叠区域，二倍体种群几乎完全被限制于大陆性气候较强的潘诺尼亚区域，而四倍体出现在另一侧，M.transsilvanicum和M.botryoides物种水平的生殖障碍仅是由于不同倍性水平和分布引起的，之前多个报道中的M.transsilvanicum和M.botryoides，并不能被证明是2个种[21]。

参考文献:

[1] KOÇAK B,ÖZHATAY,N,MATHEW B.The musk hyacinth in Turkey[J].New Plantsman,2000.

[2] 蔡曾煜.葡萄风信子[J].中国花卉盆景,2007(6):7-9.

[3] WCSP.World checklist of selected plant families[EB/OL].The Board of Trustees of the Royal Botanic Gardens,Kew.[2011-11-14]http://apps.kew.org/wcsp/qsearch.do;jsessionid=4F2786138F2C26B8A7ECFF281309B927.

[4] CUI L,WALL P K,LEEBENSMACK J H,etal.Widespread genome duplications throughout the history of flowering plants[J].Genome Research,2006,16(6):738.

[5] FLAGEL L E,WENDEL J F.Gene duplication and evolutionary novelty in plants[J].New Phytologist,2009,183(3):557-564.

[6] GARBARI F.Il Genere muscari (liliaceae):contributo alla revisione citotassonomica[J].Giornale Botanico Italiano,1968,102(2):87-105.

[7] SPETA F,ABBILDUNGEN.Eine neue ornithogalum-art (hyacinthaceae) aus der türkei als erinnerung an maria gerda JOSCHT[J].Phyton Annales Rei Botanicae,1989.

[8] STUART D C.Chromosome numbers in the genusMuscariMill[J].Edinb Roy Bot Gard Notes,1970.

[9] DALGIC G.Cytotaxonomic studies on the genusMuscariin European Turkey[J].Bot.Chronika,1991,10:819-825.

[10] Ozhatay N,Johnson M.Some karyological remarks onTurkishAlliumsect.Allium,Bellevalia,MuscariandOrnithogalumsubg.Ornithogalum[J].Bocconea,1996,5(1):239-249.

[11] KARLÉN T.Karyotypes and chromosome numbers of five species of Muscari (Liliaceae)[J].Willdenowia,1985:313-320.

[12] 戴小红,牛立新,张延龙.百合三品系代表品种的核型分析[J].西北林学院学报,2006,21(4):58-61.

[13] DOLEZEL J,GREILHUBER J,SUDA J.Estimation of nuclear DNA content in plants using flow cytometry.[J].Nature Protocols,2007,2(9):2233-2244.

[14] 李懋学,陈瑞阳.关于植物核型分析的标准化问题[J].植物科学学报,1985,3(4):297-302.

LI M X,CHEN R Y.A suggestion on the standardization of karyotype analysis in plants[J].Plant Sci J,1985,3(4):297-302.(in Chinese)

[15] 杨成超,彭建东,李晓宇,等.银白杨×白榆亲子核型分析[J].西北林学院学报,2013,28(4):80-82.

YANG C C,PENG J D,LI X Y,etal.Karyotype analysis of parents and descendants ofPopulusalba×Ulmus pumila[J].Journal of Northwest Forestry University,2013.(in Chinese)

[16] 杨东娟,唐为萍,庄东红,等.紫背三七核型分析[J].西北林学院学报,2014,29(5):137-139.

YANG D J,TANG W P,ZHUANG D H,etal.Chromosome karyotype analysis ofGynurabicolor[J].Journal of Northwest Forestry University,2014.(in Chinese)

[18] PELLICER J,LEITCH I J.The application of flow cytometry for estimating genome size and ploidy level in plants[J].Molecular Plant Taxonomy:Methods and Protocols,2014:279-307.

[19] 郭翠英,王跃进,刘雅丽,等.富含多糖葡萄风信子花瓣总RNA提取方法研究[J].西北农业学报,2007,16(3):188-191.

[20] JAFARI A,EJTEHADI H,TAGHIZADEH N,etal.Karyotype and seed protein analysis ofMuscarineglectum (Liliaceae/Hyacinthaceae) populations in North-east of Iran[J].Asian Journal of Plant Sciences,2008,7(8):730.

[21] SOMLYAY L,PINTÉR I,CSONTOS P.Taxonomic studies of theMuscaribotryoides complex in Hungary[J].Folia Geobotanica,2006,41(2):213-228.