新疆南疆规模羊场片形吸虫的基因鉴定及分析

王 娜， 徐建平， 胡建军， 崔 鑫， 张婉琪， 张莹钰， 徐 震

(1.塔里木大学动物科学学院 新疆生产建设兵团南疆动物疫病诊断与防控工程实验室， 新疆 阿拉尔 843300 ；2.新疆生产建设兵团第二师畜牧兽医工作站， 新疆 库尔勒 841000 ；3.塔里木大学生命科学学院， 新疆 阿拉尔 843300)

片形吸虫病是由片形吸虫感染引起的人兽共患病。 肝片吸虫寄生于食草哺乳动物和人的肝脏和胆管内，对肝脏造成机械性损伤，引起机体肝炎、胆管炎，导致全身中毒和营养障碍使机体发育不良甚至死亡的寄生虫病。 片形吸虫在我国有两种：肝片形吸虫(Fasciola hepatica) 和大片形吸虫(F.gigantica)，属于片形科(Fasciolidae)。 肝片形吸虫呈世界性分布，在我国也是分布最广泛、危害最严重的寄生虫病之一，遍及全国31 个省市自治区，很多呈地区性流行；大片吸虫主要分布于热带和亚热带地区，在我国多见于南方诸省、区[1]。 片形吸虫在其慢性病程中使动物瘦弱，发育障碍，乳牛产奶量减少，毛、肉产量减少和质量下降，给畜牧业带来巨大经济损失。 人感染片形吸虫可引起腹痛、发热和黄疸等症状，严重者甚至危及生命。

传统的分类学主要依据片形吸虫成虫的形态，结合生活史、流行病学等特征对虫体进行分类鉴定，对于形态比较规则的虫体鉴别比较有效。 而两种片形吸虫形态极其相似，且片形吸虫种内个体差异较大，同一虫种又因宿主的种类、宿主的反应的不同而不同，导致虫体的形态极其不规则，这就使得利用传统的分类学方法对识别一些亲缘种及隐藏种有一些难度。 本研究以形态学鉴定为基础，结合PCR 鉴定方法，从分子生物学分类角度来鉴定在形态上较难分辨其种类的片形吸虫，为新疆片形吸虫种类鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2017 年春季，新疆南疆某规模化羊场羊群中出现部分羊逐渐消瘦，食欲减退，被毛粗乱、易脱落，黏膜苍白。 该养殖场为舍饲管理，小尾寒羊与当地品种羊杂交繁殖方式。 经对3 只极度消瘦的羊只剖检，肝脏表面发现有虫体，肝组织受损，肝脏肿大，胆管增粗。 剥离肝脏中虫体，保存备用。

1.2 主要试剂 E.Z.N.A.®Stool DNA Kit(OMEGA Biotek Inc，Norcross，USA)、2 ×Taq PCR Master-Mix、DNA 凝胶回收试剂盒、TIANgel Midi Purification Kit 试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 仪器 PCR 仪(TECHNE，TC -1500)，小型高速冷冻离心机(Centrifuge 5415R，Eppendorf 公司)；电泳仪(Thermal cycler Block，Thermo Fisher 公司)；凝集成像仪(Gel DocTM XR+，Bio-RAD 公司)。

1.4 参考株 文章中涉及的肝片形吸虫、大片形吸虫、中间型吸虫的参考株均下载于NCBI 中Gen-Bank。

1.5 方法

1.5.1 片形吸虫处理及DNA 提取 取保存的完整虫体，PBS 反复冲洗，研磨、冻融并提取DNA，于-20 ℃保存备用。

1.5.2 引物 根据GenBank 参考序列，选取片形吸虫第一内转录间隔区(First internal transcribed spacer， ITS-1)和第二内转录间隔区(second internal transcribed spacer， ITS-2)基因的特异性引物作为肝片形吸虫基因分型的PCR 扩增引物[2]，2 对引物如下：ITS-1(forward：5′ -CCGTAGCCCAAATC -T-3′)和(reverse：5′-TGACTACCCCACGGA -3′)；ITS - 2(forward：5′ - ATGCACCCGGTCCT - 3′)和(reverse：5′-CATGACTTACCGAAC -3′)，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.3 PCR 反应扩增体系 ITS-1 引物的PCR 反应体系(50 μL)：2 ×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物ITS - 1F/ITS - 1R 各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL 混匀。 PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测；ITS -2 引物的PCR 体系(50 μL)：2 ×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物ITS- 2F/ITS - 2R 各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O18 μL 混匀。 PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。 取5 μL PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5.4 PCR 产物纯化回收 取PCR 扩增产物电泳切胶后，按照TIANgel Midi Purification Kit 试剂盒纯化回收PCR 产物。 送北京金诺锐杰基因科技有限公司测序。

2. 结果与分析

2.1 形态学特征 解剖镜下观察，片形吸虫背腹呈扁平，外观呈树叶状，虫体前端有一呈三角形的锥状突，后端钝圆，体表有小的皮棘。 口吸盘呈圆形，位于锥状突前端。

2.2 PCR 扩增结果 以片形吸虫ITS -1 引物、ITS-2 引物，经PCR 分别扩增出约360 bp、250 bp 大小的目的片段，与预期的目的片段大小相符(图1)。

图1 肝片形吸虫PCR 鉴定

2.3 基因序列分析 以ITS-1 引物扩增的ITS-1 基因序列，测序后在NCBI 中BLAST 比对，显示新疆南疆3 例片形吸虫ITS-1 基因序列与大片吸虫参考株ISEM V-966(法属圭亚那/2004，负鼠，AJ628403.1)和FgGZB2(中国/2004，牛，AJ628425.1)核苷酸同源性达98.2%；与肝片形吸虫参考株FhGSG2(中国甘肃/2004，山羊，AJ628431.1)和FhNJG3(中国江苏/2004，山羊，AJ628432.1)核苷酸同源性达100%；与中间型吸 虫 参 考 株 FgGZB3 (中 国 贵 州/2004， 牛，AJ628426.1)、 FhSCC19 ( 中 国 四 川/2004， 牛，AJ628427.1)、 FhHLJC4 (中 国 黑 龙 江/2004， 牛，AJ628428.1)、 FhNJG4 (中 国 江 苏/2004， 山 羊，AJ628429.1)、 FhGSG3 (中 国 甘 肃/2004， 山 羊，AJ628430.1)核苷酸同源性达98.2%(图2)。

图2 片形吸虫ITS-1 基因核苷酸同源性比较

图3 ITS-1 基因序列构建的片形吸虫系统进化树

以ITS-2 引物扩增的3 例新疆南疆片形吸虫ITS-2 基因序列与大片吸虫参考株FgC3(伊朗/2011，牛， JF432073.1)、 Shillong (印 度/2014， 羊，KJ720002.1)核苷酸同源性分别达98.7%和98.4%；与肝片吸虫参考株FhF4(中国云南/2011，奶牛，JF496717.1)、FhGZ(广州/2016，人，KU555843.1)核苷酸同源性达99.7%；与中间型吸虫参考株Khanh.Ct.1(越南/2009，牛，AB536917.1)、C -Bf104(埃及/2008，狷羚羊，AB553738.1)、FhHLJC10(中国/2011，JF708041.1)、Itanagar(印度/2014，人，KU720005.1)核苷酸同源性均达98.7%(图4)。

图4 片形吸虫ITS-2 基因核苷酸同源性比较

图5 ITS-2 基因序列构建的片形吸虫系统进化树

3 讨论

新疆是我国5 大牧区之一，放牧羊寄生虫病种类繁多，其中消化道寄生虫对羊的危害严重，导致动物生产性能下降，饲料利用率降低，产品质量下降，严重困扰新疆养羊业的发展。 新疆部分地区吸虫感染情况较为严重，井波等2008 年在新疆库车县开展的牛羊寄生虫感染调查，发现牛肝片形吸虫感染率为24.38%，大片形吸虫感染率为35.74%；羊肝片形吸虫感染率为76.04%[3]。

目前普遍认为自然界可能存在3 种不同的种类：肝片形吸虫、大片形吸虫和介于二者之间的“中间型”。 欧洲、美洲、澳洲地区只存在肝片形吸虫，而非洲和亚洲地区存在肝片形吸虫和大片形吸虫[4]。 因此，多年来，非洲和亚洲地区片形吸虫的种类鉴定一直存在很多争议[5]。 有学者认为除了有肝片形吸虫和大片形吸虫外，还可能存在片形吸虫的“中间型”[6-7]。 黄维义(2002 年)等[8]鉴定出我国黑龙江的片形吸虫有基因杂和型，认为是“中间型”的片形吸虫。

一些学者研究表明，ITS -1 序列可作为线虫、吸虫、原虫、昆虫等寄生虫分类鉴定的遗传标记。核糖体DNA 的ITS -1 基因、ITS -2 基因作为片形吸虫种类鉴定的遗传标记，其进化速度比较快，用于低级分类阶元或近缘种的系统发育研究具有独特的优势[2]。 董世娟(2004)[9]建立的特异PCR 方法，初步认为ITS-1 序列可作为遗传标记来区分大片形吸虫和肝片形吸虫，同时也证实在我国除了此两种片形吸虫外，还可能存在着“中间型”的片形吸虫。

本试验通过片形吸虫ITS -1 基因核苷酸同源性比较分析，发现新疆南疆3 例片形吸虫ITS -1 基因型与大片形吸虫核苷酸同源性为98.2%，与肝片形吸虫核苷酸同源性为100%，与中间型吸虫核苷酸同源性为98.2%；ITS-2 基因型与大片形吸虫核苷酸同源性为98.7%，与肝片形吸虫核苷酸同源性为99.7%，与中间型吸虫核苷酸同源性为98.7%。通过ITS-1 基因、ITS -2 基因核苷酸同源性比较、系统进化树分析说明，本研究中的新疆南疆3 例片形吸虫为肝片形吸虫，证实新疆南疆某羊场存在肝片形吸虫的感染。 在感染时间、地理分布等方面，新疆南疆某羊场感染的肝片形吸虫与参考株FhGSG2(中国甘肃/2004，山羊，AJ628431.1)、Fh-NJG3(中国江苏/2004，山羊，AJ628432.1)、FhF4(中国云南/2011，奶牛，JF496717.1)、FhGZ(中国广州/2016，人，KU555843.1)相比较，它们都具有相同的遗传进化起源。

本试验采用分子生物学技术，特异性ITS -1 和ITS-2 基因序列引物进行鉴定片形吸虫，传统形态学鉴定与灵敏、特异的的基因分类相结合，在一定程度上克服了形态学鉴定的局限性和主观性，为新疆的片形吸虫种类鉴定提供了科学的参考依据。