脉冲强光对副溶血性弧菌的杀菌效果及动力学

张瑞雪,揭晨奕,钱珍珠，袁勇军,2,*,管 峰

(1.浙江万里学院生物与环境学院,浙江宁波 315100;2.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江宁波 315100)

脉冲强光(Pulsed Light,PL)是一种非热杀菌技术,能利用广谱(200～1100 nm)、瞬时、高强度的脉冲光能量杀灭微生物[1]。FDA于1996年批准PL可应用于杀灭食品及包装材料表面的微生物,但剂量不得超过12 J/cm2[2]。PL对霉菌[3]、细菌[4-6]、病毒[5]及寄生虫[7]等均有明显的杀灭效果。目前国内外大多研究集中于脉冲强光的杀菌效果和初步的应用探讨,对其杀菌动力学的研究较少。

微生物致死动力学模型可以定量评价灭菌效果,并提供适当的灭菌设计标准[8],对其实际应用具有指导意义。在传统热力杀菌方法中,通常描述杀菌过程中微生物致死动力学历程的方法主要是采用一级动力学方程,如D值和Z值。加热使微生物中的某些酶被钝化或失活,而酶钝化过程通常符合一级动力学方程[9]。但是PL所造成的微生物残存活菌数的变化并不完全符合一级反应动力学方程,存在“肩部”(shoulder)或“拖尾”(tailing)现象[10]。Wooding等[11]研究表明脉冲强光灭活李斯特氏菌存在拖尾现象,一级动力学模型不适用[11]。

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)是一种嗜盐性革兰氏阴性菌,广泛分布在河口、近岸海水及其沉积物中,呈世界性分布,感染鱼、虾、蟹类以及甲壳类等多种水产品[12]。同时也是沿海地区由海产品引发导致急性肠胃炎和原发性败血症的主要致病菌[13]。目前,尚未见PL对VP杀菌的相关研究和应用的报道,本文以副溶血性弧菌为实验菌株,以Linear、Weibull、Log-Logistic模型来拟合脉冲强光的动力学曲线,比较三种模型的拟合效果,旨在分析和确定适合描述和预测脉冲强光杀菌过程的动力学模型。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副溶血性弧菌(ATCC17802) 购自中国普通微生物菌种保藏中心,保存于浙江万里学院生物与环境学院微生物实验室;蛋白胨、琼脂 杭州微生物试剂有限公司;氯化钠、盐酸、氢氧化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

PL设备(ZWS-Y1-D2) 由宁波中物光电杀菌技术有限公司生产。设备由抛光不锈钢制成,并用金属外壳围绕的一个处理室,备有2盏疝气灯和一个位于中心的活动挡板。光源参数:灯管总长400 mm,极距380 mm,直径8 mm。如图1所示,紫外区能量占总能量18.8%,其中UVA占7.2%,UVB占7.7%,UVC占3.9%。工作参数:辐照频率0.5或1 Hz,距离灯管中心10 cm处的单次脉冲剂量为67、92、113 mJ/cm2。紫外线峰值为247 nm,辐照度为102.8 w/cm2,脉冲宽度35 ms。

图1 脉冲强光光谱Fig.1 Pulse light spectrum

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 称取蛋白胨15.0 g,氯化钠30.0 g,溶于1000 mL蒸馏水中,用1.0 mol/L NaOH调节pH至7.5,121 ℃高压灭菌15 min。固体培养基在以上配方基础上添加2.0%琼脂。

1.2.2 菌悬液制备 将活化好的菌株接种到液体培养基中,37 ℃培养6.0 h,按1.0%接种量接种于50 mL液体培养基中,37 ℃培养18.0 h,5000 r/min离心15 min后,收集菌体,3.0%氯化钠盐水洗3次,重悬浮于3.0%氯化钠盐水中,制成菌体悬液,4 ℃保存备用。

1.2.3 副溶血性弧菌菌悬液的脉冲强光处理 取1.0 mL样品置于无菌培养皿(直径90 mm)中,垂直放于距离脉冲灯下30 cm处,设置辐照剂量分别为67、92、113 mJ/cm2,分别处理0、2、4、6、8、10、15、20、25 s,设3组平行,以平均值±标准偏差汇报结果。

1.2.4 微生物计数 样品处理后立即进行微生物计数。具体参照GB 4789.7-2013进行。PL处理后菌落数记为N(CFU/mL),未经脉冲处理的菌悬液的菌落数记为N0(CFU/mL)。杀菌效果即致死率采用菌数减少的对数值lg(N/N0)和杀菌率S(%)(式1)来表示。

S(%)=(N0-N)×100/N0

式(1)

1.3 数学模型的建立

1.3.1 Linear模型 该模型假设同一种细菌具有相同的抗逆性,致死动力学可用线性模型来描述,即细菌下降的对数值随时间的变化呈线性变化,如式(2)所示。

lg(N/N0)=-t/D

式(2)

式中:N为处理后菌液副溶血性弧菌菌数CFU/mL;N0处理前菌液中菌落数CFU/mL;t为处理时间,s;D为指数递减时间,即每减少90%的活菌所需要的时间,s。

1.3.2 Weibull模型 Weibull模型是一种能够对微生物灭菌的时间概率分布进行拟合和预测的概率模型,认为同一种群中的细菌其抗逆性存在差异。其模型方程可表示为

lg(N/N0)=-btn

式(3)

式中:b为比例因子;n为形状因子(n<1曲线呈凹形,n>1曲线呈凸形,n=1曲线呈线性);t为处理时间。

1.3.3 Log-logistc模型

lg(N/N0)=-A/(1+exp1+(τ-t)/A)

式(4)

式中:A为上下渐近线之差,lgCFU/mL;σ为微生物最大失活速率,lg CFU/mL·s-1;τ表示最大失活速率对应的时间,s。

1.4 模型的验证和评价

用同样的实验方法,通过重复实验,取得单次辐照剂量为67、92、113 mJ/cm2,辐照距离为30 cm,分别处理1、3、5、7、9、11、14、19、21 s时检测的菌落对数减少量,与建立的副溶血性弧菌的杀菌动力学模型求得1、3、5、7、9、11、14、19、21 s时的预测值进行比较计算,进行模型有效性和可靠性的验证。

采用SPSS 19.0和Origin 8.0对实验数据进行Linear模型、Weibull模型、Log-logistic模型拟合处理,得到脉冲强光灭菌的动力学方程,以精确因子(Af)、偏差因子(Bf)、均方根误差(RMSE)和决定系数(R2)四个参数作为一种定量的方法来评价模型[14-16]。公式如下:

式中：a预测值;β实测值,m实验值个数。

2 结果与分析

2.1 辐照剂量对副溶血性弧菌杀菌效果的影响

由图2可知,PL的辐照剂量和时间对副溶血性弧菌菌落数影响很大,不同辐照剂量下,菌落总数呈下降趋势。在67、92、113 mJ/cm2辐照剂量下,副溶血性弧菌数随着剂量的增加而显著降低(p<0.05)。当2 s时,辐照剂量从67 mJ/cm2增加到113 mJ/cm2,副溶血性弧菌残存率对数值降低了1.25 lgCFU/mL。辐照剂量增加,随着时间延长,副溶血性弧菌残存率对数值降低的幅度降低,不同辐照剂量之间无显著性差异(p>0.05),趋于平稳。其原因是可能存在菌落叠加现象,光线传播中受到传播介质的散射、折射、衍射等现象,使到达菌落表面的光强度降低,如若细菌叠加,阴影效应造成光线无法传播,延长时间也难以显著降低细菌数量(p>0.05)[17]。

图2 脉冲强光对副溶血性弧菌的致死曲线Fig.2 Pulsed light sterilization curves of Vibrio parahaemolyticus

2.2 模型拟合曲线

运用Linear模型、Weibull模型和Log-logistic模型拟合脉冲强光的杀菌动力学曲线,67、92、113 mJ/cm2辐照副溶血性弧菌的致死拟合曲线如图3所示。

图3 副溶血性弧菌在不同辐照剂量下Weibull模型、Log-logistic模型和Linear模型的拟合曲线Fig.3 Vibrio parahaemolyticus at different flash fluence with Weibull,Log-Logistic and Linear models

2.3 模型拟合度评价

Linear模型、Weibull模型和Log-logistic模型拟合PL对副溶血性弧菌杀菌效果的拟合方程相应参数如表1所示。副溶血性弧菌在67、92、113 mJ/cm2的脉冲辐照剂量下致死曲线拟合的有效性比较的参数R2、RMSE、Af和Bf如表2所示。结果表明,副溶血性弧菌在67 mJ/cm2辐照剂量处理下,Linear、Weibull和Log-logistic模型的R2值分别为0.966、0.995、0.967。92、113 mJ/cm2辐照剂量下,Linear模型的R2值分别为0.679、0.615。Weibull与Log-logistic模型的R2>0.9,R2趋于1拟合度越佳,由此可见,随着辐照剂量的增加,Linear模型不再适合描述脉冲强光致死曲线,而Weibull与Log-logistic模型可以很好地描述这一过程。由表2可知,Weibull模型与Log-logistic模型参数R2、RMSE、Af和Bf整体上较为接近。Weibull模型的RMSE和Af相对于Log-logistic模型略小,说明Weibull模型预测的平均精确度较高,离散程度较低;同时Weibull模型的Bf和R2更接近于1。因此,Weibull模型较Log-logistic模型可更好的拟合脉冲强光对副溶血性弧菌致死动力学过程。

表1 3种动力学模型拟合曲线参数Table 1 Kinetic parameters of three fitting models for inactivation of Vibrio parahaemolyticus by pulsed light

表2 Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型的致死曲线拟合参数Table 2 Fitting parameters of Linear,Weibull and Log-Logistic models under different fluence

为了比较Weibull模型和Log-logistic模型回归方程所得预测值和实测值的接近程度,如图4所示,可知67 mJ/cm2辐照剂量下,Weibull预测值与实测值线性回归方程:y=0.988x-0.038(R2=0.993),Log-logistic模型拟合方程:y=0.978x+0.932(R2=0.970)。实测值和预测值间一致性越好,其曲线斜率和相关性系数越接近1,方程截距越趋于0[18]。在67 mJ/cm2辐照剂量下,Weibull模型回归方程斜率为0.988,相关系数R2为0.993,均较Log-logistic模型更趋于1,截距为0.038,也较Log-logistic模型更趋于0。当辐照剂量为92 mJ/cm2时,Weibull模型实测值与预测值回归方程:y=0.941x-0.159(R2=0.944),Log-logistic模型实测值与预测值回归方程:y=0.914x-0.286(R2=0.892)。Weibull模型实测值与预测值相关系数R2较Log-logistic模型实测值与预测值R2更趋于1,当辐照剂量为113 mJ/cm2时,Weibull模型实测值与预测值R2为0.987,Log-logistic模型R2为0.949,结果表明Weibull模型在脉冲强光灭活副溶血性弧菌动力学过程略优于Log-logistic模型。

图4 脉冲强光对副溶血性弧菌杀灭效果的Weibull模型与Log-logistic模型预测值和实测值的相关性Fig.4 Correlation between observed and predicted values for inactivation of Vibrio parahaemolyticus in pulsed light according to Weibull model and Log-logistic model注:a、c、e分别为67 mJ/cm2、92 mJ/cm2和113 mJ/cm2辐照剂量下,Weibull模型预测值与实测值相关性,c、d、f分别为67、92和113 mJ/cm2辐照剂量下,Log-logistic模型预测值与实测值相关性。

3 结论

在67、92、113 mJ/cm2辐照剂量下,脉冲处理2、4、6、8、10、15、20、25 s可显著降低副溶血性弧菌数量(p<0.05)。辐照剂量越高,处理时间越长,杀菌效果越好。113 mJ/cm2辐照剂量处理25 s,副溶血性弧菌残存率降低5.63 lg CFU/mL,杀菌率为99.96%。

Weibull模型和Log-logistic模型较Linear模型均能更好拟合脉冲强光灭活副溶血性弧菌的动力学过程。Weibull模型R2>0.97,RMSE<0.3,Af为1.040～1.122,Bf为0.997～1.033;Log-logistic模型R2>0.92,RMSE<0.4,Af为1.089～1.103,Bf为0.948～0.994。综上所述,Weibull模型更加简洁、灵活实用,拟合度更高,更适用于脉冲强光杀菌条件的预测和优化。

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