实时荧光定量PCR技术在实验教学中的应用

赵玉红, 李 欣, 赵立青, 李小菊, 石建党, 李登文, 张金红, 周 浩

(南开大学 生物实验教学中心, 天津 300071)

实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)是在传统PCR(聚合酶链式反应)技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术[1],具有快速、灵敏、特异性强、污染少且能实时监测等优点,被广泛应用于mRNA表达分析、基因定量分析、点突变分析、等位基因分析、单核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对多种传染病病原体的定量定性分析等[2]。其基本工作原理是:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累来实时监测整个PCR进程,得到产物扩增曲线,然后采用合适的数据分析方法,计算初始模板数量(绝对定量)或初始模板数量的相对比值(相对定量)[3]。

为使学生掌握这项在生命科学中广泛应用的先进核酸定量分析技术,设计“实时荧光定量PCR分析IPTG诱导EGFP基因在大肠杆菌中的异源表达”综合实验。将EGFP基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。以IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)不同的诱导浓度、不同的诱导温度对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因进行诱导表达,分析IPTG不同诱导浓度、不同诱导温度对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。

1 实验材料与仪器

菌株：含pET-28a-EGFP质粒的大肠杆菌BL21。

主要试剂：细菌RNA提取试剂盒(Omega)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)，荧光定量预混试剂盒(SuperReal,TIANGEN)，LB培养基以及巯基乙醇、IPTG等。

主要仪器：实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad-IQ5)，高速冷冻离心机(Beckman J-25)，金属浴(卡尤迪)，涡旋混合仪(上海沪西-WH-2)以及超微量分光光度计(Nanodrop2000c)等。

2 实验方法

2.1 大肠杆菌诱导培养及菌体收集

(1) 大肠杆菌诱导培养：在LB培养基中加入Amp(氨苄青霉素)至终质量浓度为100 mg/L,37 ℃、200 r/min振荡培养过夜;将过夜培养的大肠杆菌按1%的接种量接种于新的LB培养基(Amp终质量浓度为100 mg/L),37 ℃、200 r/min培养,OD600至0.6～0.8。

(2) 菌体收集：分装菌液,共10份,每份10 mL,按照表1添加一系列浓度的IPTG,分别于16 ℃诱导培养18 h、37 ℃诱导培养3 h。每3 mL收集一管菌体,可直接提取总RNA或-80 ℃保存备用。

表1 IPTG不同浓度、不同温度诱导培养下的大肠杆菌

2.2 大肠杆菌总RNA提取

参照试剂盒说明书。取3 mL菌液,4 ℃,5 000×g、离心6 min,去上清；加入100 μL溶菌酶/TE buffer,涡旋30 s,30 ℃、温育10 min；加入350 μL BRK和30 mL beads,充分涡旋5 min,13 000g、离心5 min；取400 μL上清转移至1.5 mL新管,70 ℃温育5 min,13 000g、离心2 min；取上清转移至新管,加入280 μL无水乙醇,剧烈涡旋15 s；将所有样品转移至2 mL离心管的吸附柱内,9 000g、离心30 s；加入400 μL RNA洗脱bufferⅠ,10 000g、离心2 min,弃洗脱液和收集管；加入500 μL洗脱bufferⅡ,9 000g、离心30 s,弃洗脱液；9 000g、空离2 min；转移柱子至1.5 mL新管,加60 μL DEPC水,9 000g、离心1 min,重复1次。以DEPC水作为参照,用超微量分光光度计检测RNA浓度及其纯度。

2.3 反转录-PCR

以Oligo(dT)18作为引物,参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒使用说明书,按表2配制反转录体系,充分混匀,瞬时离心。每个样品做3个平行,阴性对照不加模板RNA。RT-PCR反应条件:25 ℃,5 min；42 ℃,60 min；70 ℃,5 min；4 ℃,Forever。所得cDNA可直接用于实时荧光定量PCR或-80 ℃保存备用。

表2 逆转录合成cDNA的体系

2.4 实时荧光定量PCR

2.4.1 PCR特异性引物的设计和合成

利用NCBI 上Gen Bank数据库,查询EGFP和大肠杆菌16S rRNA基因的mRNA序列,利用Primer 5.0软件设计引物,并用BLAST进行同源性比较,按引物设计原则和 BLAST 同源性比较结果,确定目的片段序列及长度。引物由华大基因合成。

16SrRNA-up1:CTTGCTGCTTTGCTGACGAG

16SrRNA-dn1:GGTCCCCCTCTTTGGTCTTG

扩增片段长度为125 bp。

EGFP-up1:CAAGATCCGCCACAACATCG

EGFP-dn1:GACTGGGTGCTCAGGTAGTG

扩增片段长度为120 bp。

2.4.2 反应体系

反应体系见表3。

表3 实时荧光定量PCR反应体系

2.4.3 反应程序

荧光定量扩增反应程序:(1)95 ℃预变性5 min；(2)95 ℃变性10 s；(3)60 ℃复性10 s；(4)72 ℃延伸20 s，(2)—(4)进行40个循环；(5)在反应程序结束后,以0.5 ℃/5 s的速率从60 ℃缓慢递增到95 ℃,连续测定样品的荧光强度,进行熔解曲线分析。

2.4.4 统计学分析

用Excel 建立数据库,应用SPSS17.0 统计软件包进行统计分析,组间比较采用方差分析检验,以p<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 大肠杆菌总RNA提取

大肠杆菌中总RNA的提取结果见表4。结果显示,用试剂盒法提取的RNA浓度较高,同时A260/A280比值在1.8～2.2之间,表明大肠杆菌总RNA提取质量高,可用于后续的实时荧光定量PCR分析。

表4 大肠杆菌总RNA提取结果

3.2 扩增曲线

荧光定量PCR扩增结果见图1,扩增曲线呈现出荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期3个阶段,S型曲线光滑平稳,符合定量检测要求[4]。

图1 扩增曲线

3.3 熔解曲线

熔解曲线结果见图2,扩增产物为单一峰,对应目的基因EGFP的Tm(DNA溶解温度)值均一,未出现非特异性扩增和明显引物二聚体。因此,可以采用SYBR GreenⅠ法进行相对定量分析。

图2 Real-time PCR熔解曲线

3.4 IPTG最佳诱导条件的确定

采用比较阈值法(2-△△Ct法)对实时荧光定量结果进行分析。由软件对EGFP基因和16s rRNA基因的扩增曲线进行分析,分别得到相应的Ct(cycle threshold)值,以样本中的16s rRNA的Ct值作为内参,根据公式2-ΔΔCt= 2-(Ct目的基因-Ct内参)处理组-(Ct目的基因-Ct内参)对照组计算各实验组的2-ΔΔCt值,将对照组的2-ΔΔCt值设为 1,实验组

与之相比,进行相对定量。结果见图3,当IPTG浓度为270 μmol/L、诱导温度为16 ℃、诱导时间为18 h时,EGFP mRNA的表达量最大。在教学、科研工作中,可以根据实际情况选择合适的诱导条件:可以选择低温(16 ℃)、长时间诱导；也可以选择高温(37 ℃)、短时间诱导,节约时间,提高实验效率。

图3 IPTG不同温度、不同浓度诱导大肠杆菌中EGFP的表达

4 教学探讨

4.1 扩增产物检测方法的选择

常用的实时定量PCR扩增产物检测方法主要有染料法和荧光探针法2种。

(1) 双链DNA结合染料。某些染料能结合到双链DNA上,发射荧光,并且结合后的染料发光强度明显增加。随着PCR过程中双链的指数级增长,更多的染料结合到双链DNA中,将信号进一步放大。当DNA变性时,信号又降下来。通过检测结合到双链DNA上的荧光染料,可以观察到一个动态的扩增过程。但该方法有2个缺点: 一是它的特异性完全依赖于引物,二是荧光信号的强弱依赖于双链DNA的质量而不是分子数,因而特异性相对较低[5]。

(2) 荧光探针法。荧光探针法主要包括水解探针(hydrolysis probe)、分子信标(molecular beacon)和杂交探针(hybridization probe)等[6-7],利用各种不同探针与DNA特异性的结合,提高检测的灵敏度,但需要合成高成本的荧光探针,成本较高。

本实验采用实时荧光定量PCR中常用的SYBR Green Ⅰ染料法。SYBR GreenⅠ是一种非饱和性荧光染料,能够结合到双链DNA的小沟部位,实时监测扩增进程,而且价格相对较低、通用性好,能够满足一般的教学需求。但是,由于SYBR GreenⅠ能与任何ds DNA结合,因此它也能与非特异性的ds DNA(如引物二聚体)结合,使实验产生假阳性结果[8],影响定量的准确性。为提高检测结果的灵敏度,本实验选用大肠杆菌中高度保守的16S rRNA序列设计引物，并确立最佳的退火温度，结合熔解曲线(melting curve)优化反应条件,排除非特异性扩增和引物二聚体与染料非特异性结合而引起的干扰。

4.2 内参基因的选择

合适的内参基因对于目的基因的数据校正非常重要,正确选择内参基因可以降低起始样本质和量的误差以及反应效率的误差[9]。理想的内参基因应满足以下条件:在分析的组织或样品中表达稳定；表达不受内源性或外源性因素的影响;表达水平与目的基因表达水平相近；不存在假基因(pseudogene)的干扰。

因此在进行实时荧光定量PCR分析时,应根据实际情况选择合适的内参基因,以提高实验数据的准确性和可靠性。

4.3 数据分析

常见的实时荧光定量分析包括相对定量和绝对定量两种方法。

(1) 相对定量。通过比较目的基因和内参基因的相对含量变化来判断基因转录的变化。

(2) 绝对定量。使用一系列已知起始拷贝数的标准品绘制标准曲线,建立Ct值与起始模板量对数值之间的线性关系。通过未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出未知样品的起始拷贝数。

本实验采用了相对定量中常用的2-△△Ct法,其中△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参)实验组-(Ct目的基因-Ct内参)对照组。实验中,要求学生了解实时荧光定量PCR的扩增曲线、荧光阈值、Ct值3个概念，掌握荧光阈值设定的基本原则、明确Ct值的概念以及以Ct 值进行定量的原理。

4.4 实验注意事项

(1) RNA提取过程中所用的枪头、离心管等皆为RNase free,且经高压灭菌处理。

(2) 菌体生长到对数生长期,OD600达到0.6～0.8之间时,再进行诱导培养。

(3) IPTG浓度梯度设计要合理,以保证荧光定量分析时Ct值具有明显的梯度差,利于数据分析[10]。

(4) 为尽量减少操作误差,在制备反应体系时应先制备混合反应液,混匀后再分装到PCR反应管中。

(5) 为提高实验结果的可靠性,需要设置重复实验和阴性对照。设置重复性实验的目的在于按照统计学要求,对数据进行严格的校正以消除误差[8]；设置阴性对照的目的在于检测实验中所用的引物、模板、酶等是否受到污染,若体系中存在污染,则实验结果不可用。

(6) 由于总RNA得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素,用于定量分析的初始样品浓度不同。虽然实时定量PCR实验中会用一些看家基因来校正因样品初始浓度不同而造成的差异,但是建议保持初始模板量(RNA或cDNA)一致,尽量减少实验误差,提高结果的可靠性。

5 结语

由于受操作复杂、实验周期长、成本高等因素影响,目前在科研实验室广泛应用的实时定量PCR分析技术难以应用于本科实验教学。为此设计“实时荧光定量PCR分析IPTG诱导EGFP基因在大肠杆菌中的异源表达”综合性实验,通过培养诱导菌体蛋白表达、提取大肠杆菌总RNA、反转录、实时定量PCR、结果分析与讨论,使学生有机会在16个学时里就可以学习到这项先进的分析技术,开阔视野,为今后自主开展科学研究工作打下坚实的基础。

参考文献(References)

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[3] 易健明,屈武斌,张成岗.实时荧光定量的数据分析方法[J].生物技术通讯,2015,26(1):140-145.

[4] 杨怡姝,孙晓娜,王小利,等.实时荧光定量PCR 技术的操作实践[J].实验室研究与探索,2011,30(7):15-19.

[5] 李小菊,韩际宏,石建党.分子生物学实验教程[M].北京:高等教育出版社,2015：83-92.

[6] 王玉倩,薛秀花.实时荧光定量 PCR技术研究进展及其应用[J].生物学通报,2016,51(2):1-4.

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