黄芪多糖对鸡新城疫疫苗免疫后T淋巴细胞的影响

向双云 周珍辉 （北京农业职业学院 北京 房山 102442）

中药多糖作为新型的免疫增强剂，以其绿色、安全、高效的特性，在养禽业生产中的应用越来越广泛。黄芪多糖(Astragluspolysacchride，APS)是中药黄芪的主要天然生物活性成分。据文献报道，黄芪多糖具有增强机体免疫功能、增加机体主要免疫器官脾脏和法氏囊等重量、增加白细胞和淋巴细胞数量、提高淋巴细胞转化率和巨噬细胞活性、诱导干扰素产生等作用，对多种疫苗具有免疫增强的作用[1-4]。为进一步明确黄芪多糖对T淋巴细胞的促进作用，本试验在鸡新城疫免疫过程中添加黄芪多糖作为免疫增强剂，免疫后不同日龄采血测定淋巴细胞转化率，为临床应用免疫增强剂提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验试剂 黄芪多糖注射液(10mg/ml)，购自四川恒通动物制药有限公司；新城疫Lasota疫苗，购自青岛易邦生物工程有限公司。

1.1.2 试验仪器 离心机(型号为L-500，湖南湘仪仪器厂)，微量移液器(大龙，上海汉林实验仪器有限公司)，显微镜(EX30，舜宇光学生物有限公司)，电子天平(型号为SL502N，购自上海羽通仪器仪表厂)，高压蒸汽灭菌器(型号为Q-LS-18S)，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台(型号为VS-1300L)，购自苏净安泰空气技术有限公司；

1.1.3 试验动物 1日龄非免疫健康AA蛋鸡90只，由大信禽业有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 动物的分组及饲养管理 90只健康非免疫蛋鸡随机分为3组：黄芪多糖试验I组、黄芪多糖试验II组、生理盐水对照组，每组30只。试验期间试验动物采用笼养，全价饲料，自由采食和饮水，1～14日龄采用红外灯保温，全日制光照。从4日龄开始，试验I组注射0.5ml/只黄芪多糖注射液，试验II组注射0.8ml/只黄芪多糖注射液，生理盐水对照组注射0.75ml/只灭菌生理盐水。1次/d，连续3d。7日龄用新城疫Lasota疫苗滴鼻、点眼免疫。

1.2.2 T淋巴细胞的测定 （1）采血：于免疫前1d和免疫后1、2、3、4、5、6周每组随机抽取10只鸡，翅静脉采取抗凝血，2ml/只，加入等量的Hank’s液稀释，手动轻轻摇匀。（2）分离淋巴细胞：取2支干净的15ml离心管，分别加入2ml淋巴细胞分离液。用移液器吸取等量的静脉血和Hank’s的混合液，贴管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液的液面上，注意保持两种液面界面清晰，不要打破液面。室温下立即置离心机中2000r/min离心30min。离心后分为4层，用移液器将血浆和分离液之间的乳白色层(即淋巴细胞层)细胞悬液仔细全部吸取至另一刻度离心管中。用5倍以上体积的Hank’s液洗涤3次，每次以1500r/min离心10min，弃上清，沉淀主要为淋巴细胞。取沉淀用pH7.4含10%小牛血清和5.0g/L水解乳蛋白的Hank’s液配成1×106～2×106/ml的细胞悬液备用。（3）制备绵羊红细胞悬液：无菌操作新鲜采集绵羊静脉抗凝血，用两个15ml离心管装血液。用Hank’s液洗涤3次，前两次1500r/m离心10min，末次2000r/m离心10min后，将压积绵羊红细胞用Hank’s液配成1%SRBC(绵羊红细胞悬液)。（4）淋巴细胞与红细胞作用：用移液器分别取0.1ml淋巴细胞悬液，分别贴壁加入2支离心管(1.5ml)中，再贴壁加入等量的1%SRBC和等量的灭活的小牛血清混匀，置37℃水浴25min，期间摇动2～3次，取出后置4℃冰箱作用2h。（5）制片、镜检、计数：从冰箱取出离心管，500r/min离心5min，弃去上清液，轻轻混匀细胞悬液。取1滴细胞悬液置于事先滴有1滴美兰染色液的载玻片上，盖上盖玻片，用高倍显微镜进行观察和计数。镜下淋巴细胞呈蓝紫色或淡蓝色，红细胞为无色。凡能结合3个以上绵羊红细胞者为玫瑰花环形成阳性细胞，常规计数200个淋巴细胞，计算玫瑰花环形成阳性细胞的百分数，即T淋巴细胞的百分率。

2 试验结果

附表 T淋巴细胞测定结果

由表1可见，黄芪多糖试验I组和试验II组在免疫后不同时段的T淋巴细胞百分率均高于生理盐水对照组，差异显著(P＜0.05)，黄芪多糖试验I组和试验II组之间差异不显著(P＞0.05)。说明在进行鸡新城疫Lasota疫苗免疫前，提前注射黄芪多糖能显著提高T淋巴细胞百分率。

3 讨论与结论

T淋巴细胞是机体主要的淋巴细胞之一，在免疫应答中起核心作用，T淋巴细胞百分率是检测机体细胞免疫的重要指标，在研究及筛选免疫增强性药物等方面具有重要意义[5]。试验结果表明：黄芪多糖试验I组、试验II组T淋巴细胞的百分率高于对照组，差异显著；黄芪多糖试验I组和试验II组之间差异不显著，但试验II组的各项指标略高于试验I组，表明黄芪多糖在鸡新城疫Lasota疫苗免疫过程中能提高T淋巴细胞百分率，黄芪多糖可以作为鸡新城疫Lasota疫苗的免疫增强剂。

[1]Qiu Y, Hu Y L, Cui B A, et al. Immunopotentiating effects of four Chinese herbal polysaccharides administered vaccination in chickens[J]．Poultry Science, 2007, 86(12)： 2530-2535.

[2]毛小娟. 红芪和黄芪多糖的免疫调节作用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 1988(6)： 365.

[3]林继和, 姚中磊, 王世杰. 复方中药对免疫新城疫和禽流感疫苗三黄鸡抗体产生的影响[J]. 中国家禽, 2011, 33(9)： 64-65.

[4]王福厚, 张进隆, 刘根新. 黄芪多糖、当归多糖对鸡新城疫弱毒苗免疫增强作用[J]. 畜牧兽医杂志, 2011, 30(4)： 1-2.

[5]崔治中, 崔保安. 兽医免疫学[M]. 北京： 中国农业出版社, 2014.