马铃薯晚疫病菌原生质体制备及再生体系的研究

王伟伟 肖燕 张艺夕 刘晶 唐唯 李灿辉

（1. 云南师范大学生命科学学院，昆明 650500；2. 云南师范大学马铃薯科学研究院，昆明 650500）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）属茄科一年生草本植物，原产地南美洲安第斯山区，是世界第三大粮食作物［1］。我国是世界上马铃薯主要生产国家之一，马铃薯也是我国第四大粮食作物。由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病是一种毁灭性病害，已超过稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害［2］。

致病疫霉（Phytophthora infestans）是半活体营养型卵菌，菌丝无色、无隔、多核，生活史包含有性生殖和无性生殖两个过程，其无性生殖是田间侵染植物的主要方式。马铃薯晚疫病菌为二倍体，基因组大小约240 Mb，其中包含上千个与致病性相关的效应因子与毒性因子。

为进一步明确晚疫病菌的致病机理，需要建立高效的马铃薯晚疫病菌的遗传转化体系。早在1991年，Judelson等［3］参考植物叶肉细胞的转化体系，首次在致病疫霉中建立了用聚乙二醇/氯化钙（PEG/CaCl2）介导的原生质体转化技术，目前PEG介导的原生质体转化体系在其他卵菌中也获得成功，其中包括大豆疫霉［4］（Phytophthora sojae）、同丝水霉［5］（Saprolegnia monoica）、棕榈疫霉［6］（Phytophthora palmivora）、烟草疫 霉［7］（Phytophthora nicotianae）、葱 疫 霉［8］（Phytophthora porri） 以 及 橡 树 疫 霉［9］（Phytophthora ramorum）等。

影响原生质体制备的条件有很多，如酶的种类、酶的浓度、酶解时间和酶解温度等。由于不同微生物细胞壁的组成成分不同，所以不同物种要选择合适的酶进行酶解。Weiland［10］等使用纤维素酶（Cellulase）和葡聚糖酶（Dextranase）对坪草枯萎病腐霉进行酶解；陈孝仁［11］等使用崩溃酶（Driselase）和裂解酶（Lysing enzyme）对大豆疫霉菌进行酶解；付丽［12］等使用裂解酶（Lysing enzyme）和纤维素酶对辣椒疫霉进行裂解；刘士旺［13］等使用溶壁酶（Glucancx）、纤维素酶、破壁酶（Lywallzymc）和蜗牛酶（Snail enzyme）对绿色木霉进行酶解，其中Glucancx的裂解效果要比其他单一酶及其组合酶的效果好，可能是由于P. infestans的细胞壁含有纤维素和β-1，3-葡聚糖多聚物。本研究选用Driselase和Cellulase R-10两种酶，分别在不同酶浓度、酶作用时间及不同菌龄条件下进行原生质体制备和再生的研究，旨在建立高效的马铃薯晚疫病菌原生质体制备和再生体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 致病疫霉（Phytophthora infestans）菌株110P于2017年分离自云南省昆明市寻甸县，由云南师范大学马铃薯科学研究院保存。

1.1.2 培养基 致病疫霉生长培养基［14］：PDA培养基：将土豆去皮并切成小块，称200 g，加入500 mL水，煮20 min后过滤，取滤液，在滤液中加入15 g葡萄糖，用蒸馏水定容至1 L，用1%氢氧化钠或盐酸将PH调至6.8-7.2，加入15 g琼脂粉，搅拌均匀，121℃灭菌20 min。黑麦V8液体培养基：60 g黑麦用蒸馏水浸泡36 h，煮沸1 h，4层纱布过滤后加V8蔬菜汁100 mL，蔗糖20 g，1 g CaCO3，搅拌均匀，用蒸馏水定容至1 L，调PH至7.0，121℃灭菌20 min。原生质体再生培养基［15］：黑麦V8固体培养基，在1 L黑麦V8液体培养基中加入15 g琼脂，91.1 g甘露醇，调PH至7.0，121℃灭菌20 min。

1.1.3 原生质体洗液［16］渗透压调节剂Ⅰ：0.35 mol/L氯化钙，主要用于原生质体的制备。渗透压稳定剂Ⅱ：0.1 mol/L氯化钙，0.4 mol/L甘露醇，主要被用于冲洗酶液和稀释原生质体。分别将这两种渗透调节物质调节PH至6.2，并于121℃灭菌20 min。

1.1.4 细胞壁裂解酶 Driselase（Lot.No.1220E021）、Cellulase R-10（Lot.No.926E023）均购于 Solarbio 公司。裂解酶液用渗透压调节剂Ⅰ配制，两种酶分别配成终浓度为5 mg/mL、10 mg/mL和15 mg/mL，混匀后1 000 r/min离心2 min取上清，经0.22 μm的微孔滤膜除菌，现用现配。

1.2 方法

1.2.1 原生质体的制备 供试菌株置于PDA培养基上，18℃黑暗培养10-18 d，沿菌落边缘切5 mm×5 mm的菌丝块，挑10块置于装有100 mL的黑麦V8液体培养基的锥形瓶中，于18℃、120 r/min黑暗摇培8 d，400目筛子过滤收集菌丝体，用灭菌的无菌水冲洗3次后用全自动样品快速研磨仪（Fstgrd-24，上海净信科技）于30 Hz频率下研磨90 s，再用400目的筛子过滤，收集的菌丝体用灭菌蒸馏水冲洗3次，渗透压调节剂Ⅰ冲洗两次，用灭菌滤纸吸干，称重；将菌丝移至50 mL锥形瓶中，加入细胞壁裂解酶液5-15 mL，于26℃、100 r/min条件下裂解细胞壁。消化后的细胞悬浮液经400目筛子过滤，同时用渗透压稳定剂Ⅱ洗涤沉淀3次，最后用渗透压稳定剂Ⅱ重悬沉淀，均匀混合，即可得到原生质体。以上步骤均在无菌条件下操作。制备好的原生质体在光学显微镜下计数［11］。

1.2.2 原生质体的再生 在灭菌的超净工作台上，分别取50、100、150 μL原生质体悬浮液涂布于再生培养基上，18℃黑暗培养5 d，计数小菌落，按照下列公式计算原生质体再生率。实验重复2次。

再生率=（再生培养基上生长的菌落数/涂布原生质体总数）×100%。

2 结果

2.1 原生质体的制备

2.1.1 马铃薯晚疫病菌无性孢子和原生质体的形态 在普通的光学显微镜下就可以观察无性孢子（图1-A）和原生质体（图1-B）的区别，可以清晰的观察到柠檬型的无性孢子、部分未被酶解呈丝状的菌丝体和呈圆形的原生质体。在原生质体制备的过程中发现，有些菌丝体已经形成断片，可以看到正在形成原生质体的菌丝体末端膨胀变大，释放出呈圆球状的原生质体；也可以观察到有一些菌丝体不是从两端释放，而是从中间释放出原生质体（图2）。

2.2 原生质体制备条件的优化

裂解酶的确定。在酶浓度10 mg/mL、反应温度在26℃条件下，Driselase、Cellulase R-10对致病疫霉细胞壁的裂解效果都达到了较高水平，其中Driselase在60 min时原生质体的产量达到9.0×104个/g，Cellulase R-10在45 min时原生质体的产量达到 8.5×104个 /g。

图1 致病疫霉无性孢子与原生质体的区别

图2 致病疫霉原生质体的形成方式

2.2.2 裂解酶浓度和反应时间的确定 用Driselase、Cellulase R-10分别裂解致病疫霉菌丝的细胞壁，制备的原生质体的数量随着酶液浓度的增加而有明显变化，10 mg/mL时产生的原生质体数量最多，15 mg/mL时产生的原生质体数量反而有所下降。因此进行大量原生质体制备时，酶浓度以10 mg/mL最为高效、经济和适用。

从酶处理15 min开始，随着处理时间的延长，原生质体产量也逐渐增加，Driselase在60 min时，原生质体产量最大，达到9×104个/g；而Cellulase R-10在45 min时，原生质体产量最大，达到8.5×104个/g；60 min后，随着酶解时间的延长，原生质体产量呈下降趋势（图3、4）。因此，根据上述结果，致病疫霉原生质体制备最佳条件为Driselase以10 mg/mL的浓度裂解60 min。

图3 Driselase酶不同浓度和处理时间对原生质体的影响

图4 Cellulase R-10酶不同浓度和处理时间对原生质体的影响

2.2.3 菌龄对马铃薯晚疫病菌原生质体制备的影响 在最佳原生质体制备条件下，使用10 mg/mL Cellulase R-10和分别生长18 d、14 d、10 d的110P菌丝体进行原生质体的制备。结果显示，3个菌龄的110P菌丝体中，生长18 d的菌丝体原生质体制备总量最高，为7×104个/g。各菌龄条件下原生质体制备量，见表1。

表1 原生质体制备量

2.3 原生质体的再生

致病疫霉110P用10 mg/mL的Driselase和Cellulase R-10处理60 min后，分别取 50 μL、100 μL、150 μL原生质体悬浮液涂布于再生培养基上，菌落在培养4-5 d时开始大量形成，对平板菌落计数后，原生质体再生率最高达3.1%。实验重复2次。原生质体的再生率，见表2。

表2 原生质体的再生率

3 讨论

探究马铃薯晚疫病菌原生质体制备和再生的适宜条件，菌龄、脱壁酶的选择、酶解时间、酶浓度和渗透压稳定剂等都会对原生质体的形成率和再生率产生不同影响。本实验以培养18 d的菌丝体为材料，用10 mg/mL Driselase处理1 g菌丝60 min后，原生质体产量达8.5×104个/g；以0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂，以黑麦V8固体再生培养基得到的原生质体再生率最高达3.1%。

由于不同种疫霉菌的细胞壁成分和结构不同，所以选择合适的脱壁酶对原生质体的产量有很大的影响［17］。Weiland 等［10］使用 Cellulase和 Dextranase坪草腐霉进行酶解发现混合酶液的原生质体产量较高；陈孝仁等［11］使用Driselase和Lysing enzyme两种酶对大豆疫霉菌进行酶解发现，在崩溃酶中加入裂解酶后原生质体产量明显增多。卵菌的细胞壁主要有纤维素和β-1，3-葡聚糖多聚物组成，因此本研究参考选用了Driselase和 Cellulase R-10两种细胞壁裂解酶。Driselase是一种复合酶，内含昆布多糖酶（Laminarinase）、木聚糖酶（Xylanase）和纤维素酶（Cellulase）［18］，而 Cellulase R-10是一种单一的纤维素酶，一般来说，混合酶液比单一酶液的脱壁效果好，但Driselase是一种复合酶且含有纤维素酶，本研究用两种酶分别探索对P. infestans的裂解效果，结果发现两种酶制备效率差异不显著（P＞0.05），但Cellulase R-10价格便宜，在大量制备要求下较为经济适用。

探索最佳酶解时间，是获得最佳原生质体制备方法的重要数据之一。同时，还应该注意裂解作用的最适温度，若温度不当，可能会导致原生质体被破坏。在原生质体的制备过程中，酶浓度宜适中，酶浓度太大易使菌体凝集，不易形成原生质体，酶浓度太小使酶解不彻底。酶解时间也是影响原生质体制备的重要因素，如陈孝仁［11］等在制备大豆疫霉原生质体时，酶解时间在3 h时，原生质体的产量较高；黄玉茜［19］在制备绿色木霉时，酶解时间在24 h时，原生质体的产量较好。根据前人文献报道发现原生质体的产量是随着酶解时间的增加而增大，当达到最高量时，随着酶解时间进一步延长，原生质体的产量逐渐降低，整个过程呈钟型曲线趋势，达到最高点原生质体产量下降的主要原因是因为酶活随着作用时间增加而降低，或原生质体数目不断增加，在酶解体系中会变得不稳定［20］。本研究所得致病疫霉菌丝酶解作用的最佳时间为Driselase 1 h，Cellulase R-10仅45 min，比已有文献报道时间的疫霉属卵菌裂解时间都短，因此，利用本优化条件，在制备原生质体的过程中效率更高。

菌龄不同的细胞，其细胞壁的薄厚程度以及结构差异较大，是影响原生质体制备影响的关键因素之一。菌龄短的菌丝体细胞壁成分相对简单，细胞壁也相对薄，容易裂解，但并不是菌龄越短，原生质体的生成率越高。菌龄过短会造成菌丝量不足或影响原生质体的再生［21］。不同种类的卵菌酶解时的最佳菌龄是不一样的，Yi等［16］的研究报道辣椒疫霉的菌龄在5 d时原生质体的生成率较高；Judelson等［4］的研究发现大豆疫霉的菌龄在11 d时原生质体的生成率较高。本研究探索的最佳菌龄为18 d，一个主要原因就是在最适培养基和最适温度条件下，致病疫霉110P菌丝生长速率为6.4-7.5 mm/d（本研究测得），大豆疫霉菌丝生长速率为7-9 mm/d［22］，辣椒疫霉为3-4 mm/d［23］，致病疫霉的营养菌丝生长速率较低。

在原生质体的再生过程中，渗透压稳定剂是原生质体释放后维持活力的重要因素，对原生质体再生率影响显著。卵菌的细胞壁成分是纤维素和葡聚糖，根据Yi等［16］的研究，用0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂时，辣椒疫霉的原生质体再生率接近6%；董磊［20］用1 mol/L的氯化镁、0.8 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂时，致病疫霉的原生质体再生率较高，但低于Yi等［16］研究的辣椒疫霉的原生质体再生率；本研究选用0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂，原生质体再生率最高达3.1%。

研究并建立卵菌高效遗传转化系统，原生质体制备和再生是必不可少的重要方法之一。以原生质体为核心的多种操作技术研究已经建立，包括原生质体的制备、再生、诱变、融合等方面，在基础理论研究和实际生产应用中，这些技术都发挥着重要作用［24］。由于不同属、不同种甚至不同生理小种在制备和再生过程中都存在一定的差异性，因此制备原生质体的具体方法和再生条件都有所不同，制备率和再生率波动也很大［11］，因此，不同的致病疫霉菌株之间的差异也必然存在，在进一步研究中，应着重探索不同菌株间原生质体制备和再生条件差异、混合裂解酶的制备率，以及渗透压稳定剂的优化。

4 结论

本研究以致病疫霉菌丝为材料，研究了不同菌龄、2种细胞壁裂解酶、3个裂解酶浓度、8个裂解时间梯度的原生质体制备条件和再生效率，建立了原生质体最佳制备条件，暨以培养18 d的菌丝体为材料，用10 mg/mL Driselase处理菌丝60 min后，原生质体产量达9.5×104个/g；同时研究还发现，以0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为原生质体渗透压稳定剂，以黑麦V8为再生培养基，得到的原生质体再生率能达到3.1%。

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