端粒结合蛋白Rap1促进化疗药物诱导的胃癌细胞衰老相关分泌表型

姚婷婷 王静云 陆文全 吕 帅 李 昕 宁寒冰

(郑州大学第一附属医院消化内科，河南 郑州 450052)

衰老细胞分泌炎症细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶等，称为细胞衰老相关分泌表型(SASP)〔1〕。治疗(包括化疗、放疗等)诱导的肿瘤细胞SASP(TIS)促进肿瘤发展、转移、复发、耐药及化疗药物引起的短期和长期副作用〔2〕。端粒是位于染色体末端的DNA-蛋白结构，由TTAGGG重复序列和大量的端粒结合蛋白组成。6个端粒结合蛋白TRF1、TRF2、Rap1、POT1、TIN2 和TPP1组成Shelterin复合体〔3〕。研究证明端粒结合蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用〔4〕。Rap1是Shelterin复合体中一个特殊的因子，研究显示哺乳动物Rap1至少拥有3种独特的功能：端粒功能；转录调控；在胞质抑制核转录因子(NF)-κB信号通路〔5〕。在酿酒酵母衰老过程中，Rap1离开端粒并重新定位于数百个新靶基因的上游启动子区域，促进衰老相关基因表达，推动衰老进程〔6〕；在皮肤成纤维细胞衰老和氧化应激时，Rap1水平下降〔7〕。研究显示：依托泊苷(etoposide)或阿霉素(ADR)诱导胃癌细胞Rap1表达增高，药物诱导的Rap1表达升高通过参与DNA损伤修复，促进胃癌细胞多药耐药〔8〕。本研究探讨端粒结合蛋白Rap1在化疗药物诱导的胃癌SASP中的作用。

1 材料和方法

1.1细胞和试剂 人胃癌细胞系SGC7901来源于第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室。细胞生长于含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2条件下常规培养。etoposide购自Sigma-Aldrich。抗体：抗Rap1(Abcam，ab14404)，抗p16INK4a(Abcam，ab16123)，抗p53(Cell Signaling，9282)，抗白细胞介素(IL)-1A(Abcam，ab9614)，抗IL-6(Abcam，ab9324)，抗IL-8(Abcam，ab7747)，抗血管内皮生长因子(VEGF)-A(Abcam，ab51745)，抗干扰素(IFN)-γ(Cell Signaling，3F1E3)，抗γ-tubulin (Abcam，ab11316)。

1.2诱导细胞衰老 1×106个细胞接种于直径10 cm的培养皿，37℃培养过夜；将培养液更换为低血清2%FBS，分别加入空白培养液(对照组)和5 μmol/L etoposide(试验组)，处理1、5、7、9 d，每3 d更换含有vehicle或5 μmol/L etoposide的新鲜培养液。收集条件培养液时，更换为新鲜不含药物培养液继续培养24 h。

1.3β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色 根据衰老细胞组织化学染色试剂盒(Sigma-Aldrich)说明书进行SA-β-Gal染色，显微镜下观察细胞SA-β-Gal染色。

1.4AlamarBlue检测 细胞生长曲线采用AlamarBlue分析(Life Technologies)。细胞按照1 × 104/孔接种于96孔板，37℃培养过夜。vehicle或5 μmol/L etoposide处理后，加入AlamarBlue试剂，37℃继续培养2 h，检测570 nm吸光值(A)，实验重复3次，细胞活力=(实验组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)×100%。

1.5Western印迹检测 裂解细胞提取总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，应用电转移将电泳分离后的蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上，滤膜经5%脱脂奶粉于室温封闭后，依次与一抗及辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育，以电化学发光法(ECL)显色。

1.6RT-PCR RNeasy试剂盒(Qiagen)提取细胞总RNA，逆转录试剂盒(Roche)合成cDNA，RT-PCR采用Roche公司LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I System，将GAPDH设为内参。引物见表1。

表1 Real-time PCR引物列表

1.7酶联免疫吸附法(ELISA)检测 收集不同细胞条件培养液，根据Human Quantikine ELISA试剂合(R&D Systems)说明书检测IL-1A、IL-6、IL-8、VEGF、IFN-γ表达，结果表示为与阴性对照组检测值的比值。

1.8转染 前期实验构建的Rap1 siRNA和阴性对照siRNA载体〔8〕采用LipofectamineTM2000(Invitrogen)分别瞬时转染SGC7901细胞(分别命名为SGC7901-Rap1 KD和SGC7901-NC)，SGC7901-Rap1 KD分别用空白培养液及5 μmol/L etoposide 处理1、5、7、9 d(分别为Rap1 KD对照组及Rap1 KD试验组)，SGC7901-NC分别用空白培养液及5 μmol/L etoposide 处理1、5、7、9 d(分别为NC对照组及NC试验组)。4组检测指标及方法同对照组及实验组。

1.9统计学方法 使用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组细胞增殖情况及Rap1、SASP相关因子表达比较 试验组第3天后细胞停止生长，见表2。与对照组比较，试验组第5天细胞SA-β-Gal染色增加，p53及p16INK4a蛋白表达升高，见图1、图2。与对照组比较，试验组第1、5、7、9 d Rap1 mRNA显著升高(P<0.001), 第5、7、9天SASP相关因子(IL-1A、IL-6、IL-8、VEGF-A、IFN-γ mRNA均显著升高(P<0.05，P<0.001)。与对照组比较，试验组细胞条件培养液中第5、7、9天IL-1A、IL-6、IL-8 mRNA均显著升高(P<0.05，P<0.001)，第7、9天VEGF-A、IFN-γ mRNA均显著升高(P<0.05)。见表3、表4。

图1 两组SGC7901细胞第5天SA-β-Gal染色(×400)

图2 两组培养第5天p53及P16INK4a表达

图3 两组Rap1和SASP相关因子蛋白表达

组别第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天对照组1．00±0．741．14±0．031．93±0．203．51±0．245．33±0．226．25±0．196．80±0．266．80±0．08试验组1．00±0．051．89±0．081．47±0．111．60±0．101)1．60±0．091)1．60±0．201)1．49±0．131)1．52±0．231)

与对照组比较：1)P<0.05

表3 两组Rap1和SASP相关因子mRNA表达比较

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.001;下表同

表4 两组细胞条件培养液中SASP相关因子表达比较

2.24组细胞增殖情况及Rap1 mRNA、p53、p16INK4a表达比较 Rap1 KD对照组、Rap1 KD试验组、NC对照组及NC试验组Rap1 mRNA表达相对密度分别为0.43±0.04、0.64±0.05、1.17±0.02、4.13±0.19，Rap1 KD对照组与NC对照组、Rap1 KD试验组与NC试验组比较Rap1 mRNA表达相对密度均显著降低(P<0.05)，见图4。Rap1 KD试验组及NC试验组第3天后细胞均停止生长，见表5。NC试验组与NC对照组比较、Rap1 KD试验组与Rap1 KD对照组比较，第5天细胞SA-β-Gal染色增加，p53及p16INK4a蛋白表达显著升高，见图5、图6。

1:Rap1 KD对照组，2：Rap1 KD试验组，3：NC对照组，4：NC试验组图4 4组Rap1蛋白表达

2.3Rap1敲除抑制SASP表达 与NC试验组比较，Rap1 KD试验组第5天IL-1A、IL-6、IL-8、VEGF-A、IFN-γ mRNA均显著降低(P<0.05，P<0.001)。与NC试验组比较，Rap1 KD试验组细胞条件培养液中第5、7、9天IL-1A、IL-6、IL-8 VEGF-A、IFN-γ mRNA均显著升高(P<0.05，P<0.001)。见图7、表6。

图5 4组细胞第5天SA-β-Gal染色(×400)

组别第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天NC对照组1．00±0．112．64±0．195．01±0．876．61±0．428．43±0．3210．04±0．5810．43±0．4510．49±0．83Rap1KD对照组1．00±0．192．64±0．344．10±0．275．43±0．157．55±0．459．08±0．439．51±0．469．45±0．54NC试验组1．00±0．082．03±0．772．64±1．053．12±1．071)3．26±1．081)3．35±0．661)3．28±0．331)3．21±0．831)Rap1KD试验组1．00±0．302．44±0．263．09±0．333．39±0．322)3．94±0．492)3．90±0．302)4．15±0．672)4．05±0．592)

与NC对照组比较：1)P<0.05; 与Rap1 KD对照组比较：2)P<0.05

表6 NC试验组及Rap1 KD试验组细胞条件培养液中SASP相关因子表达比较

与NC试验组比较：1)P<0.05，2)P<0.001

1:Rap1 KD对照组，2：Rap1 KD试验组，3：NC对照组，4：NC试验组图6 4组p56、p16INK4a蛋白表达

图7 Rap1 KD试验组及NC试验组Rap1和SASP相关因子蛋白表达

3 讨 论

TIS在肿瘤治疗中发挥着复杂的“双刃剑”式作用，一方面细胞处于生长停滞状态，抑制细胞增殖，并通过SASP相关因子促进免疫清除〔9〕；另一方面，证据证实：TIS诱发局部和全身性炎症，促进化疗药物引起的短期和长期副作用，包括骨髓抑制、心脏损伤、肿瘤复发、衰竭等〔10〕。此外，TIS促进肿瘤耐药，通过诱导上皮-间质转化(EMT)和增加肿瘤细胞侵袭力促进肿瘤转移〔11〕。

Rap1是具有多种端粒和端粒外功能的调控蛋白，与衰老和肿瘤发展密切相关。在乳腺癌和肝癌中发现Rap1表达升高，抑制细胞凋亡，增加肿瘤侵袭性〔12〕。Rap1结合于染色体的某些非端粒位点，调节细胞黏附因子、肿瘤及代谢等相关基因转录。Rap1通过转录调控和NF-κB信号通路调节炎性因子表达，抑制Rap1降低间充质干细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1的分泌，提高细胞存活及在心肌梗死中的治疗效果；Rap1促进NLRP3炎性小体，导致移植肝脏损伤〔13〕；Rap1促进巨噬细胞分泌炎性因子，促进动脉粥样硬化发展〔14〕。研究显示，胞质Rap1和胞核NF-κB p65在胃癌组织中的表达呈显著正相关，可能与NF-κB信号转导通路共同参与胃癌的发生发展有关〔15〕；Rap1调控TRF2在化疗药物诱导的DNA损伤修复中的作用，参与胃癌耐药的发生〔8〕。而DNA损伤反应和NF-κB信号通路都是SASP调控因子〔16〕，本研究进一步证实，Rap1调控化疗药物诱导的胃癌细胞SASP。在低剂量etoposide诱导的胃癌细胞衰老过程中伴随Rap1表达升高，Rap1表达升高出现于etoposide处理的早期阶段，并在衰老细胞中持续存在；Rap1敲除不影响etoposide诱导的细胞衰老，但抑制并延迟SASP表达。因此，Rap1可能通过调控TIS促进胃癌发展及耐药，抑制Rap1将为胃癌治疗提供新的靶点。

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