固本舒喘颗粒对哮喘豚鼠的免疫调节作用

俞 琦 冯 果 田维毅

(贵阳中医学院基础医学院，贵州 贵阳 550025)

固本舒喘汤原方由黄芪、何首乌、地龙、苦参、防风等十味中药组成，对支气管哮喘防治效果显著〔1〕。前期研究〔2〕在固定处方的基础上，将汤剂制成固本舒喘颗粒，并建立了稳定、可控的质量标准。目前普遍认为哮喘的发病机制与免疫失衡有密切关系，本研究探讨固本舒喘颗粒治疗哮喘的部分免疫机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康豚鼠50只，雌雄各半，体重180～200 g，购自贵州医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(黔)20020001。动物随机分为正常对照组、模型对照组、固本舒喘颗粒大、小剂量组、泼尼松组各10只。

1.2药物和主要试剂 自制固本舒喘颗粒，批号：20081102。卵白蛋白(厦门市健众生物制品工程有限公司)，Diff快速染色液(上海钰博生物科技有限公司，批号：YB40748ES60)，醋酸泼尼松片(上海信谊药厂有限公司，批号：100502)，豚鼠免疫球蛋白(Ig)E试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，白细胞介素(IL)-4、IL-5、干扰素(IFN)-γ试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司)。

1.3仪器 电子分析天平(梅特勒上海公司)，高速低温离心机5804D(德国Eppendorf公司)，超声雾化器(上海天源医用生物有限公司)，ELX800全自动酶标仪(美国BioTek公司)。

1.4制备哮喘模型 参照文献方法〔3〕造模。正常对照组除外，其余4 组每只豚鼠分别用10%卵白蛋白腹腔注射，1 ml/只。首次致敏15 d后，将致敏豚鼠置于4 L密闭玻璃罩中，按400 mmHg恒压喷入5%卵白蛋白溶液0.5 min，激发至豚鼠出现烦躁、打喷嚏、呼吸急促、腹肌强烈收缩及伏地现象，为造模成功标准。1次/d，共激发7 d。

1.5给药 于雾化当天开始灌胃给药，根据制剂研究结果确定的用药剂量，用生理盐水稀释药物，固本舒喘颗粒大、小剂量组分别以10、5 g/kg，泼尼松组以0.001 g/kg灌胃给药，灌胃体积为0.5 ml/100 g体重，正常对照组代以等体积生理盐水，每天1 次，连续7 d。参照文献〔4〕，观察豚鼠发生呼吸困难、咳嗽的情况，判断豚鼠反应级数。分级方法：1级，仅见呼吸困难；2级，可见呼吸困难和咳嗽；3级，呼吸困难、咳嗽、甚至休克跌倒。

1.6血清IgE、IL-4、IL-5和IFN-γ的测定 末次雾化24 h后，股动脉取血，3 500 r/min离心10 min，分离血清，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IgE、IL-4、IL-5和IFN-γ水平，具体操作按试剂盒说明进行。

1.7细胞计数 豚鼠末次雾化24 h后，开胸结扎右主支气管，用37℃无菌生理盐水5 ml推入右主支气管进行灌洗，反复抽吸3次，回收灌洗液。肺泡灌洗液(BALF)经4℃，2 000 r/min离心10 min，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀细胞，取5 μl进行细胞计数；取10 μl常规涂片，进行Diff-Quick快速染色，显微镜下分类计数细胞(至少连续计数300个细胞)。

1.8统计学方法 应用SPSS18.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1各组气道反应级数比较 激发后，模型对照组气道反应性显著增高，出现躁动，呼吸急促，抽搐等表现，休克死亡1只。与模型对照组(2.43±0.33)比较，泼尼松组、固本舒喘颗粒大、小剂量组反应级数均明显降低(1.40±0.13、1.60±0.29、2.10±0.25；P<0.05，P<0.01)。

2.2各组血清IgE水平比较 与正常对照组〔(25.96±2.37)μg/ml〕比较，模型对照组血清IgE水平显著升高〔(48.30±3.64)μg/ml,P<0.01〕。与模型对照组比较，泼尼松组和固本舒喘颗粒大、小剂量组IgE水平明显下降〔(30.74±2.30)、(32.09±2.72)、(36.80±3.41)μg/ml,P<0.01〕。

2.3各组血清细胞因子比较 与正常对照组比较，模型对照组血清中IL-4、IL-5水平明显升高，IFN-γ水平显著降低(P<0.01)。与模型对照组比较，固本舒喘颗粒各剂量组和泼尼松组均能显著降低豚鼠血清IL-4水平(P<0.05或P<0.01)，提高IFN-γ水平(P<0.01)；固本舒喘颗粒大剂量组、泼尼松组能明显降低IL-5水平(P<0.01)，见表1。

表1 各组血清细胞因子比较

与正常对照组比较:1)P<0.01；与模型对照组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.4各组BALF炎症细胞表达比较 与正常对照组比较，模型对照组BALF中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及细胞总数明显上升(P<0.01)。与模型对照组比较，泼尼松组和固本舒喘颗粒大、小剂量组均能显著降低BALF细胞总数和炎症细胞的表达(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 固本舒喘颗粒对哮喘模型豚鼠BALF炎症细胞表达的影响

3 讨 论

哮喘的发病机制非常复杂，现代医学认为，哮喘的发病与诸多炎症细胞、生物介质等多种免疫因素有关〔5〕，机体免疫异常在哮喘的发病中占据核心地位〔6〕。研究发现，嗜酸性粒细胞在气道内聚集和激活能直接促发气道炎症反应，其数量与病情的严重程度呈正相关〔7〕；中性粒细胞可分泌氧代谢类、酶类和花生四烯酸等代谢产物，诱导多种细胞因子合成与释放〔8〕；淋巴细胞和巨噬细胞也是引发哮喘气道炎症的关键角色。辅助性T细胞(Th)1/Th2免疫失衡一直被认为是哮喘发病的关键环节，在整个气道炎症过程乃至气道重塑发生过程中，都起着极其重要的作用〔9，10〕。Th2型细胞主要分泌IL-4，IL-5等细胞因子，可正向调节IgE生成与活性，刺激嗜酸粒细胞增殖、活化，并同时引起组胺、白三烯等多种炎性介质释放〔11，12〕；IFN-γ由Th1细胞分泌，主要参与细胞分化的调节，能抑制Th2型细胞的活性，从而对气道炎症产生有效的抑制作用〔11〕。除以上免疫因素外，气道反应性和血清IgE水平也是反映哮喘炎症反应的重要指标〔13〕。固本舒喘颗粒原方具有益气和卫、和血祛风、纳气平喘之功效，主要用于气虚卫弱、卫气不固所致的虚喘之症。本研究结果均提示固本舒喘颗粒具有显著免疫调节作用，其治疗哮喘的作用机制可能与其下调血清IgE、IL-4和IL-5水平，上调IFN-γ表达及降低肺泡炎症细胞数量有关。

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7唐以军，徐永健，熊盛道，等.动态监测哮喘患者诱导痰嗜酸性粒细胞的临床意义〔J〕.临床内科杂志，2003；20(9)：463-5.

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10McKee AS，Pearce EJ.CD25+CD4+cells contribute to Th2 polarization during helminth infection by suppressing Th1 response development〔J〕.J Immunol，2004；173(2)：1224-31.

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