葡萄籽原花青素对放射性脑损伤大鼠学习能力和生长相关蛋白-43表达的影响

张慧民 肖 颖

(唐山工人医院，河北 唐山 063000)

放射性脑损伤(RIB)是颅面颈区肿瘤放射治疗后的常见并发症，接受全脑照射并存活患者出现认知功能障碍的概率高达50%～90%，且认知障碍的程度往往与照射的剂量有关〔1〕。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中提取出的生物类黄酮物质，具有极强的抗氧化和清除自由基作用〔2〕；GSPE不仅可抑制肿瘤细胞的生长、迁移；同时可减轻辐照引起的脏器损伤〔3～5〕。本研究建立RIB模型，观察神经元再生突触重塑的首选分子学标志——内源性再生相关因子生长相关蛋白(GAP)-43的表达变化。

1 材料与方法

1.1动物分组和模型制备 62只雄性SD大鼠随机分成对照组，模型组，高剂量GSPE组各18只、低剂量GSPE组8只。照射后7、14和28 d为观察时间点。对照组：动物只进行常规麻醉，不进行照射；模型组：动物常规麻醉，参考文献〔6〕制作RIB模型,方法：采用德国进口加速器产生的6 MeV电子线对大鼠进行单次全脑照射，源皮距为100 cm，吸收剂量率250 MU/min，吸收剂量为22 Gy；GSPE组：动物照射方法同模型组；在动物进行照射前2 w开始每天灌胃给药1次,持续给药至观察时点，低、高剂量GSPE组分别为100、200 mg/kg。

1.2学习能力评测 采用ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统测定动物行为学能力。将各组大鼠按时间点分别放入穿梭箱，适应5 min消除探究反射后给予铃声刺激5 s，继之给予电击20 s，间隔10 s后进入下一轮训练。训练中，如果在铃声刺激5 s内大鼠逃向安全区，则为主动回避反应，系统自动停止当次训练；如果在铃声刺激5 s内大鼠未逃向安全区，则给予1.5 mA交流电20 s，如果在电击后逃向安全区，则为被动回避反应阳性，否则为主动、被动回避反应阴性。每只大鼠电击30次，记录被动回避潜伏期(PAL)、主动回避反应次数等参数。主动回避反应次数占总训练次数的百分比即为主动回避反应率(AARR)；AARR越高，PAL越短，表明动物学习能力越强。

1.3脑组织皮质区形态结构观察 各组各时间点取3只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织。石蜡包埋、冠状切片，片厚5 μm，HE染色。光学显微镜下观察。

1.4免疫组织化学法和RT-PCR法检测GAP-43表达 免疫组织化学法：取材动物及标本采集与HE染色方法相同，切片常规脱蜡至去离子水，滴加复合消化液后入加入37℃温箱孵育20 min，经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次5 min，入3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min，经PBS洗涤后滴加兔抗鼠GAP-43多克隆抗体(1∶300)，4℃过夜；37℃复温45 min，PBS洗涤后滴加生物素化二抗，37℃ 40 min，PBS洗涤；二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精轻度复染，脱水透明，封片。在有测微尺的光学显微镜(20×10)下计数该视野下的阳性细胞数(细胞核中有阳性表达产物，染色呈棕黄色)。RT-PCR法：各组各时间点取3只大鼠,致死后迅速取双侧海马区组织，称量0.6 g,加入1 ml RNAiso Plus溶液后匀浆，室温静置5 min后12 000 r/min 4℃离心5 min，取上清移至新的1.5 ml离心管内，加入1/5RNAiso Plus溶液体积的氯仿，震荡混匀后室温静置5 min，12 000 r/min 4℃离心15 min，将上清液转移至新离心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液体积的异丙醇，室温静置10 min，12 000 r/min 4℃离心10 min，弃掉上清液，用与RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7 500 r/min 4℃离心5 min，弃上清保留沉淀，干燥(不可加热)，溶解于30 μl DEPC处理水中，测量OD260/280值，根据OD260计算RNA浓度，-80℃保存。检测步骤：GAP-43引物正义链:5'CCCAAGCTTCCATGCTGTGCTGTATGAG3';反义链:5'GGGTACCCTCAGGCATGTTCTTGGTC3';上海生工生物技术有限公司合成。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件进行方差分析，SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组穿梭实验结果比较 与对照组相比，模型组AARR明显减少、PAL明显延长，差异有统计学意义(P<0.05),且至照射后28 d时，AARR和PAL恢复迹象不明显；与模型组相比，GSPE组AARR明显增多、PAL明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)，且28 d时AARR和PAL恢复迹象明显，高剂量GSPE效果更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 各组AARR比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与低剂量组比较：3)P<0.05，下表同

表2 各组PAL比较

图1 各组海马区神经元形态结构变化(HE，× 400)

2.2各组神经细胞形态结构改变 对照组神经细胞形态结构正常,胞体较大，胞核大而圆，核仁清晰。模型组可见神经细胞变性水肿,细胞轮廓模糊;亦可见部分死亡细胞,表现胞体收缩呈多角形或不规则。GSPE组神经细胞形态结构减轻，在高剂量组变化尤为明显。见图1。

图2 各组海马区GAP-43免疫组化染色结果(DAB，×400)

2.3各组GAP-43免疫组织化学和RT-PCR结果 免疫组织化学GAP-43阳性表达主要位于细胞质，阳性细胞的胞质可见细小的棕黄色颗粒，见图2。对照组有少量GAP-43阳性细胞，染色棕黄；与对照组比较，模型组7、14 d时间点GAP-43阳性细胞均明显增多，28 d有所降低，但仍明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，GSPE组各时间点GAP-43阳性细胞明显增多，高表达状态持续至28 d，在高剂量组变化尤为明显，差异有统计学意义(P<0.05),见表3。RT-PCR结果显示：与对照组比较，模型组7、14 d时间点GAP-43 mRNA表达水平明显增高，28 d有所降低，但仍明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组组比较，GSPE组各时间点GAP-43 mRNA水平进一步增高，高表达状态持续至28 d，在高剂量组变化尤为明显，差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

表3 各组海马区GAP-43免疫组织化学阳性细胞数比较个/视野)

表4 各组海马区GAP-43 mRNA表达水平比较

3 讨 论

本研究说明GSPE对RIB学习障碍有较好的防治作用。电离辐射可以造成脑内氧化应激，炎症反应，进而导致神经元损伤、神经递质释放紊乱等，认知能力损伤〔7,8〕。因此应用具有较强抗氧化作用的GSPE〔其抗氧化能力是维生素(Vit)E的50倍、VitC的20倍，与超氧化物歧化酶(SOD)相当〕可以降低RIB造成的认知障碍。此外GSPE具有抑制炎症通路激活和炎症反应的作用。近期学者相继报道了GSPE通过抑制氧化应激和P38MAPK炎症信号激活而起到睡眠呼吸暂停低氧大鼠空间记忆损伤的改善作用〔9,10〕。

GAP-43是轴突生长因子的代表，脑损伤刺激后，未受损神经细胞大量合成GAP-43，可通过与胞内信息分子G蛋白等相互作用，提高兴奋性氨基酸受体的反应性，释放钙调素，促使轴突侧支出芽和形成，允许神经元轴突继续延伸，调控神经元细胞骨架的重新装配、有利于神经通路的整合〔11〕；黄海玲等〔12〕的研究显示参芎化瘀胶囊可改善全脑缺血大鼠神经功能，与升高脑内GAP43的表达有关。有学者〔13〕证实淫羊藿苷、低氧训练等方法具有促使脑损伤后神经再生和神经功能恢复的作用，其机制均与上调脑内GAP-43表达有关。冀胜军等〔14〕建立急性RIB模型，发现神经再生标记物神经元抗核抗体双阳性细胞至照射后30 d仍处在较低水平；利用神经影像学发现〔15〕接受放射性治疗的鼻咽癌患者脑内与神经发生密切相关物质如N-乙酰天门冬氨酸(NAA)和胆碱(Cho)等物质减少，且与放射的剂量有关。上述研究表明RIB认知障碍的形成与神经发生障碍密切相关。本研究显示GAP-43在GSPE组呈剂量依赖式显著增高，且高表达状态时间延长，说明GSPE可提高GAP-43表达水平，促进神经发生，进而对放射性认知损伤起到很好的防治作用。

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5李玉白，黄红焰.花青素协同葡萄糖醛酸对辐射大鼠肝功能的影响〔J〕.中国医科大学学报，2013;42(11)：1025-31.

6范兴文，贯士阔，吴开良.脑部照射对大鼠情绪和记忆的影响〔J〕.中国癌症杂志，2014;24(11)：841-9.

7张娴娴，肖 璐，徐 耀.依达拉奉对放射性脑损伤模型大鼠认知功能障碍的影响〔J〕.中华放射医学与预防杂志，2013;33(1)：40-3.

8Jenrow KA，Brown SL，Lapanowski K，etal.Selective inhibition of microglia-mediated neuro-inflammation mitigates radiation-induced cognitive impairment〔J〕.Radiat Res,2013;179(5):549-56.

9Zhao YN,Guo X,Wang HY,etal.The neuroprotective effects of grape seed proanthocyanidin on rat brain injury caused by chronic intermittent hypoxia〔J〕.Neurol Asia,2014;19(4):399-403.

10赵雅宁,王红阳,刘文钱,等.葡萄籽原花青素对睡眠呼吸暂停模式低氧大鼠海马区磷酸化p38MAPK和IL-1β表达的影响〔J〕.中风与神经疾病，2013;11(1)：40-3.

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12黄海玲，李建民，赵亚宁.参芎化瘀胶囊对大鼠全脑缺血再灌注损伤及其海马CA1 区生长相关蛋白43表达的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2014;34(2)：185-90.

13徐成成,张鹏飞,丁新生,等.淫羊藿苷对脑缺血大鼠PTEN和GAP-43蛋白表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志,2015;32(1):4-7.

14冀胜军，孙 锐，蔡 尚，等.组蛋白H3乙酰化在电离辐射所致神经发生障碍中的作用〔J〕.中华医学杂志,2015;95(5):19-25.

15宋 琼，夏黎明，王承缘，等.鼻咽癌放射治疗后放射性脑损伤急性反应早期的1H-MR波谱研究〔J〕.中华放射学杂志,2006;40(6):590-3.