安徽省泗县猪附红细胞体病流行病学调查

许魁 徐前明 张志忠

摘要 [目的]对安徽省泗县猪附红细胞体病进行流行病学调查。[方法]从泗县3个乡镇收集300份疑似病例血样，对其进行血液涂片检查、PCR检测和基因测序。[结果]不同规模或饲养方式的猪场猪附红细胞体感染情况不同。从调查地点来看，墩集镇猪场感染率最高，达65%；其次是黄圩镇，感染率为44%；大庄镇猪场猪附细细胞体感染率最低，为39%。仔猪感染率低于育肥猪，育肥猪感染率为54.67%，仔猪感染率仅44.00%。[结论]安徽省泗县猪附红细胞体病感染率较高，应加强预防和控制。

关键词 泗县；猪附红细胞体病；流行病学；调查

中图分类号 S851.31+3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0079-03

Abstract [Objective] To make the epidemiological investigation of porcine eperythrozoonosis in Sixian County of Anhui Province.[Method] 300 suspected blood samples were collected from three towns of Sixian County to make blood smear test，PCR detection and gene sequencing.[Result] The infection situations of Eperythrozoon suis in pig farms with different scale or feeding methods were different.From the survey locations，the infection rate in pig farms of Dunji Town was the highest （65%），followed by that in Huangwei Town （44%），the infection rate in pig farms of Dazhuang Town was the lowest（39%）.The infection rate of piglets was lower than that of fattening pigs （54.67%），while the infection rate of piglets was 44.00%.[Conclusion] The infection rate of E.suis in Sixian County was higher，so its prevention and control should be strengthened.

Key words Sixian County；Porcine eperythrozoonosis；Epidemiology；Investigation

猪附红细胞体病是危害养猪业较为严重的疫病之一，常引起溶血性黄疸、呼吸困难、身体虚弱、体温升高、血液稀薄等症状，造成病猪高热稽留不退、厌食绝食、咳嗽和气喘。公猪尿鞘积尿，精神差；母猪产后奶水不足、哺育功能较弱。患病猪主要表现为繁殖障碍或生育障碍，这些问题给我国畜牧业带来了巨大的经济损失[1-2]。为了全面了解安徽省泗县猪感染附红细胞体情况，笔者选取黄圩镇、大庄镇和墩集镇为调查点，选择30个具有代表性的猪场作为调查对象，采集全血300份，对其进行血液涂片检查、PCR检测和基因测序。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与载体。大肠杆菌DH5α；pMD-18T载体购自TaKaRa公司。

1.1.2 主要试剂。

血液基因组DNA提取试剂盒和PCR试剂盒，均购自美国Omaga公司；DNA Maker 2000、琼脂糖和溴化乙锭（EB）等均购自天根生物有限公司。

1.1.3 调查地点和调查对象。选择具有代表性的墩集镇、黄圩镇、大庄镇3个乡镇为调查地点，选取30个具有代表性的猪场作为调查对象，调查这3个乡镇养殖场猪附红细胞体的感染情况。

1.2 方法

1.2.1 血液基因组提取。血液基因组提取按照Omaga血液基因组提取试剂盒说明书操作。

1.2.2 引物设计。

参照Messick[3]的方法进行引物设计。结合GenBank数据库中登录的16S rRNA序列，并将其作为模板，使用Primer primer 5.0软件设计引物，P1为AAAAAGGCCCTCGGGTCTTT，P2为TCAATTATGTCCCAGGCACT。

1.2.3 目的基因的PCR扩增。PCR反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃下保存。

1.2.4 基因测序与分析。对菌落PCR鉴定为阳性的菌株进行序列测定，对所测定的序列在NCBI网站进行Blast序列分析，并使用MEGA 4.0软件构建遗传进化树。

1.2.5 数据统计与分析。

将试验数据进行汇总与统计分析，比较不同地点、规模、月龄和症状猪附红细胞体的感染情况。

2 结果与分析

2.1 临床症状观察

试验猪均表现出一定的患附红细胞体病的特征。抽检猪中，体温升高30头，检出23头感染附红细胞体，检出率为76.67%；皮膚变色40头，检出24头感染附红细胞体，检出率为60%；饮食减少60头，检出24头感染附红细胞体，检出率为40%；气喘咳嗽20头，检出12头感染附红细胞体，检出率为60%；排泄稀薄70头，检出35头感染附红细胞体，检出率为50%；精神萎靡80头，检出30头感染附红细胞体，检出率为37.50%。

2.2 血涂片染色鏡检结果 取血样制成血涂片，采用瑞氏血涂片染色法进行染色并镜检。从图1可以看出，猪血液红细胞发生变形，且表面有附红细胞体分布[4-5]。

2.3 PCR检测结果

从图2可以看出，PCR扩增产物经电泳检测后发现700 bp左右的条带，与预期结果相符。

2.4 基因测序结果

阳性克隆经序列测定后，其大小700 bp，同源性分析结果表明其与猪附红细胞体的同源性达85%。

2.5 不同地点养殖场的感染情况比较

由表1可知，虽然取样猪场都在泗县范围内，由于地理位置和环境不同，猪感染附红细胞体情况也存在差异。总体来看，在黄圩镇检测的100头猪中，可检出44头附红细胞体呈阳性，感染率达44%；在大庄镇检测的100头猪中，39头猪呈阳性，感染率达39%；在对墩集镇检测的100头猪中，有65头猪体检测出附红细胞体，感染率达65%。由此可见，墩集镇受检猪附红细胞体的感染率明显高于黄圩镇和大庄镇。

2.6 不同规模养殖场的感染情况比较

由表2可知，50头以下规模的猪场附红细胞体感染率明显高于200头以上规模的猪场。200头以上猪场共检出48头（黄圩镇15头、大庄镇12头、墩集镇21头），50头以下猪场共检出100头（黄圩镇29头、大庄镇27头、墩集镇44头）。

2.7 不同月龄猪群的感染情况比较

由表3可知，1～3月龄猪共150头，附红细胞体感染检出头数为66头（黄圩镇19头、大庄镇17头、墩集镇30头），检出率为44%；4～6月龄猪共150头，附红细胞体感染头数82头（黄圩镇25头、大庄镇22头、墩集镇35头），感染率为54.67%。4～6月龄猪附红细胞体的感染率高于1～3月龄。

3 讨论与结论

3.1 附红细胞体感染情况

此次对泗县猪感染附红细胞体情况的调查发现，抽检猪群感染率总体达49.33%，其中低月龄仔猪感染率为44%。此次调查结果与邰秀珍等[6]报道的夏秋季猪群附红细胞体的感染率基本相一致。这说明该地区存在猪感染附红细胞体情况，在不同规模猪场均有附红细胞体污染现象，其中育肥感染率相对最高，总体达54.67%。

3.2 猪附红细胞体病的诊断

建立猪附红细胞体病的高效诊断方法是控制该病的有力手段和前提条件。附红细胞体病症状临床上并不是同时发生和存在的，而且还有别的疾病有同样的症状，这就要求提高鉴别诊断手段的准确率。临床上最需要鉴别诊断的是猪瘟、猪巴贝斯虫（猪焦虫）和猪肺疫，尤其与猪瘟的外部表现较为类似，在发病初期极端仅仅通过对症状进行观察是很难做出准确判断，只有等到发病中后期通过尸体解剖检测的方式才能够进行鉴别。

血涂片检查法是血涂片经姆萨染色或吖啶橙染色对血液样本进行染色，然后用显微镜对涂片进行观察。附红细胞体姬姆萨氏染色呈蓝紫色或粉红紫色。瑞氏染色呈淡蓝色。吖啶橙染色呈淡绿色荧光。它们的优点都是简单易操作，特征明显易观察。姬姆萨氏染色、瑞氏染色需注意要避免变性红细胞如豪-周氏小体红细胞、嗜碱性点彩红细胞和多染性红细胞等以及血小板、抗凝剂、染料颗粒这些因素的干扰；吖啶橙染色过程中也常常会发生假阳性事件。此外，这2种检测方法的缺点是敏感性都较低，吖啶橙染色法还需有暗室和荧光显微镜[4]。此外，上述这些方法只能观测到附着于红细胞表面的附红细胞体，而游离于红细胞内部的附红细胞体却无法得到有效地观察。若采用改良方法，将血液经生理盐水进行一定比例稀释后再染色，可在一定程度上减少染色颗粒的发生，降低假阳性率。该试验中血涂片检查也需要对猪全血进行稀释，然后染色镜检，结果发现该方法在去除杂质和染色颗粒方面有明显地改善。

PCR诊断方法具有高敏感性和特异性强等优点。在分子生物学诊断方法中最常用此方法。关于PCR方法诊断附红细胞体病报道较多。张浩吉等[7]以16S rRNA为检测目的基因，建立了PCR诊断猫附红细胞体感染情况的检测方法，证实该方法具有良好的特异性和敏感性。Oberst等[8]

在猪附红体感染高峰期取样，从中分离出猪附红细胞体。提取DNA后以32P标记制成探针，能区别感染猪和非感染猪，且不与感染其他病的猪血清中DNA发生杂交反应。后来，进一步利用PCR技术检测猪附红细胞体的感染情况，证明其敏感性高，同时证明感染附红细胞体的猪在24 h后即可检测出。

兽医临床诊断方法不准确，而PCR检测方法对于仪器设备以及操作人员的要求都过高，不适合乡镇级畜牧兽医水产站和一般规模养殖场使用，还是需要用病原学检测方法（如瑞氏血涂片染色法）进行确诊。因为病原学方法无论是成本还是设备仪器以及对操作人员的要求，都更适合乡镇兽医站和一般规模养殖场使用。

参考文献

[1] 李昕，张学军，王近香，等.猪附红细胞体病[J].中国畜牧兽医，2005，32（11）：54-57.

[2] 韩子强，杨宏军，李建基.动物附红细胞体病的研究进展[J].动物科学与动物医学，2002，19（7）：21-24.

[3] MESSICK J B.Hemotrophic mycoplasmas（hemoplasmas）：A review and new insights into pathogenic potential[J].Veterinary clinical pathology，2004，33（1）：2-13.

[4] 赵晓薇，巴彩凤.附红细胞体病的研究进展[J].中国人兽共患病学报，2007，23（10）：1047-1049，1058.

[5] 魏梅雄，马杏宝，王龙英.附红细胞体病及其分子生物学和发病机制的研究进展[J].旅行医学科学，2006，12（3）：1-7.

[6] 邰秀珍，杨殿相，秦林金，等.人类附红细胞体形态学特点[J].中国人兽共患病杂志，1998，14（5）：83-84.

[7] 张浩吉，谢明权，张健騑，等.猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用[J].中国兽医学报，2005，25（5）：480-483.

[8] OBERST R D，GWALTNAY S M，HAYS M P，et al.Experimental infections and natural outbreaks of eperythrozoonosis in pig identified by PCR-DNA hybridizations[J].J Ver Diagn Invest，1993，5（3）：351-358.