RH—2485对斜纹夜蛾幼虫蜕皮的影响

崔永涛 林佳 李广宏 王方海

摘要 [目的]了解蜕皮激素活性类化合物RH-2485对重要害虫斜纹夜蛾（Spodoptera litura）幼虫蜕皮的影响。[方法]用2 μL 100 mg/L RH-2485点滴处理斜纹夜蛾5龄幼虫，观察幼虫蜕皮和发育情况，并制作石蜡切片，在显微镜下观察被处理幼虫和对照幼虫体壁间的差异。[结果]处理6 h后，大部分试虫停止取食，接近死亡状态；12 h后，头壳开始出现脱离；24 h后，可明显观察到头壳脱离现象，新表皮和旧表皮同时存在，旧表皮松软地覆盖于新表皮之上；36 h后，表皮颜色变黑，虫体变小；48 h后，虫体仍蜕不掉旧表皮，部分呈现出“细腰”状态，或伴有后肠脱出、血淋巴流失等，多数化蛹前死亡，少数形成畸形蛹，但因不能正常羽化而死亡。同时在显微水平上观察到RH-2485处理后的幼虫体壁较对照有明显变化，在上表皮+外表皮和真皮细胞之间形成较大的间隙，真皮细胞层明显变薄。[结论]RH-2485可严重干扰斜纹夜蛾的正常蜕皮，从而导致其死亡。

关键词 RH-2485；斜纹夜蛾；蜕皮

中图分类号 Q965文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0149-04

Abstract [Objective] The aim was to explore the effect of RH2485，a kind of nonsteroids two acylhydrazine compounds with molting hormone activity，on the molt of Spodoptera litura，an important pest of agriculture.[Method] The 5th instar larvae of S.litura were treated with 100 mg/L RH2485，and their molt and development were observed.The difference between the treated larva and the control larva body wall was observed under the microscope by the Paraffin section.[Result] Most insects stop feeding and with the sublethal status after 6 h； the cuticle of head was out after 12 h；there were old and new skin at the same time，and the old skin soft covered on top of the new skin after 24 h； skin color was black and body became small after 36 h； the old skin was still existence，some showing ‘waist，or accompanied by intestinal prolapse，blood and lymphatic drain，most died before pupation，a small number of pupae formed with malformation and died before eclosion after 48 h.Observed on the micro level，the larval body wall had obvious changes compared with the control as followed：a large gap was formed between the upper epidermis & the outer epidermal and dermal cells，and the dermal cell layer became thin.[Conclusion] The RH2485 can seriously interfere with the normal molting of Spodoptera litura，leading to its death.

Key words RH2485； Spodoptera litura；Molting

蛻皮激素是调控昆虫生长发育的重要激素，可以启动昆虫旧表皮的溶解和新表皮的形成[1]。人们曾经试图将蜕皮激素开发为新型杀虫剂，但由于天然蜕皮激素在分离和提取方面比较困难、成本过高等原因，未能获得应用和推广。因此，农业生物化学家转而合成和筛选可以模拟蜕皮激素作用的各类化合物，且成功开发出新的杀虫剂[2]。二酰基肼类化合物是人工合成的非类固醇类蜕皮激素激活物，可作用于蜕皮激素受体，导致虫体过早蜕皮，使其发育有所残缺或最终死亡。深入研究发现，这类化合物处理后的试虫能启动早期基因的表达，引发蜕皮，但由于其在昆虫体内不易降解，持续存在，进而抑制了晚期基因的表达，降低了多巴脱羧酶的活性，从而使羽化激素的释放受到抑制，虫体蜕皮失败或不表现出蜕皮行为，常常形成“双头囊”而导致死亡，并伴有后肠脱出和血淋巴流失等症状，有些幼虫则会形成畸形蛹，因不能正常羽化而死亡[3-4]。

具有蜕皮激素生物活性的双酰基肼类化合物RH-5849、RH-5992、RH-0345都已经成功开发为杀虫剂，并具有明显的作用效果[4-6]。RH-2485是近期合成的一种具有蜕皮激素活性的非内固醇双酰肼类化合物，生物测定结果显示它和其他非内固醇类杀虫剂一样，具有良好的生物活性。笔者曾详细研究了RH-2485对农业害虫斜纹夜蛾（Spodoptera litura）幼虫生长发育的影响，发现具有明显的杀虫效果，并具体测定了RH-2485对不同龄期斜纹夜蛾幼虫的半数致死浓度等[7]。笔者拟在前期研究的基础上，利用石蜡切片技术，研究这种新型昆虫生长调节剂对繁殖能力和抗药性都很强的农业害虫斜纹夜蛾[8-9]蜕皮过程及新表皮形成的影响，并探讨该化合物引发不正常蜕皮的机制，以期为在田间更好地利用RH-2485防治斜纹夜蛾提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试昆虫。斜纹夜蛾幼虫由中山大学昆虫学研究所养虫室提供，用人工饲料饲养，人工饲料配方参考陈其津等[10]报道的方法，饲养条件为：温度（28±1） ℃、相对湿度60%～75%、光暗周期16 h/8 h。

1.1.2 RH-2485。具有蜕皮激素活性的化合物RH-2485购于美国Rohm-Haas公司，纯度在99%以上。将RH-2485粉末用二甲基亚砜（DMSO）溶解，稀释成100 mg/L溶液待用。

1.1.3 主要试剂。Carnoy 固定液：无水乙醇60 mL，冰醋酸10 mL，氯仿30 mL。蛋白胶：鸡蛋1枚，取出蛋清，加等量甘油，用玻棒搅拌混匀后，加入0.5 mg麝香草酚，放入4 ℃冰箱中保存待用。苏木精染液：苏木精2 g，钾矾10 g，冰醋酸10 mL，无水乙醇、甘油和蒸馏水各100 mL。首先用25 mL无水乙醇及冰醋酸溶解苏木精，顺次加入甘油、剩余75 mL无水乙醇，然后将甲矾加入蒸馏水中，加热使其全部溶化，再缓慢倒入苏木精液中，搅匀后待用。伊红染色剂：将1 g伊红加入100 mL 95%乙醇中，搅拌均匀即可。

1.2 方法

1.2.1 RH-2485处理斜纹夜蛾5龄幼虫后蜕皮过程的形态观察。根据头壳宽度，选取发育基本一致的斜纹夜蛾5龄幼虫，用移液枪吸取2 μL 100 mg/L RH-2485点滴在虫体前胸背板上，以DMSO处理组为对照。全程观察其蜕皮过程并进行拍照。

1.2.2 RH-2485处理后斜纹夜蛾5龄幼虫表皮的石蜡切片制作和观察。具体切片方法参照暴学祥等[11]的方法，主要包括固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片、粘片、染色等步骤。从二甲苯试剂中取出切片时，需清除玻片周围及底部的二甲苯，再滴加树胶，盖上盖玻片，然后封片，并粘上标签，平放晾干。采用荧光体视显微镜（ZEISS SteREO Lumar.V12）观察切片并拍照。

2 结果与分析

2.1 RH-2485处理斜纹夜蛾5龄幼虫后的形态观察 处理后6 h，试虫大部分停止取食，接近死亡状态；12 h后，头壳开始出现脱离；24 h后，可明显观察到头壳脱离现象，新表皮和旧表皮同时存在（图1），旧表皮松软地覆盖于新表皮之上；36 h后，虫体表皮颜色逐渐变黑，虫体开始皱缩；48 h后，旧表皮仍然不能蜕去，多数试虫濒临死亡或已死亡，部分呈现出“细腰”状态（图2）。还伴有后肠脱出（图3）、血淋巴流失等其他中毒症状。有些可以发育到末龄幼虫，但形成畸形蛹（图4），且因不能正常羽化而死亡。

2.2 RH-2485处理后幼虫表皮的显微观察 通过显微镜观察及拍照，RH-2485处理后斜纹夜蛾的表皮显微结构见图5。

通过显微镜观察，斜纹夜蛾体壁大体可区分出3个明显的结构，由外向内依次为上表皮+外表皮、中表皮+内表皮、真皮。与对照相比，经RH-2485处理后的幼虫体壁发生了明显变化，如上表皮+外表皮与真皮细胞之间形成大的间隙，真皮细胞层明显变薄。

3 结论与讨论

全变态的昆虫幼虫要经历多次蜕皮过程才能化蛹，然后羽化为成虫。一般情况下，皮细胞比较扁平，表皮紧紧地黏附于皮细胞。当蜕皮过程开始时，皮细胞及其附近组织开始储存和积累部分物质，并逐渐长大。随后，皮细胞细胞质突起從通道中收缩回来，表皮和皮细胞出现分离。与此同时皮细胞不断分裂而增多，且不断增大，然后在皮细胞的表面分泌形成新的表皮质层。在新旧表皮之间含有由皮细胞、皮腺或马氏管等分泌的大量蜕皮液。而蜕皮液内含有几丁质酶和蛋白酶等，可消化旧表皮的内层，使80%～90%的旧表皮被消化掉，剩下的只是不能消化的上表皮和鞣化的外表皮，消化后的产物多数被皮细胞吸收，用于新表皮的形成。在蜕皮前几小时分泌出新的蜡层，经由孔道铺在新表皮之上；然后再从皮腺分泌胶粘层铺于蜡层之上。表皮质层、蜡层、胶粘层等组成上表皮。此时蜕皮液大部分被吸收，由于昆虫身体的运动和收缩，导致蜕皮线处裂开，昆虫由此从旧表皮内爬出，这就是蜕皮过程[12]。整个蜕皮活动的起始及过程的结束是由蜕皮激素所调控的[13]。

蜕皮激素类似物RH-2485处理斜纹夜蛾幼虫后，必将影响其体内蜕皮激素的滴度变化，从而干扰其正常的蜕皮。该研究发现，RH-2485处理斜纹夜蛾幼虫后，可以启动斜纹夜蛾的蜕皮，形成一个未鞣化的新头壳，但是无法退去，经历一段时间，有些可以形成一种“细腰”结构，是表皮无法正常蜕皮所导致，幼虫保持这种状态几天，最后死于饥饿和脱水，同时伴有后肠脱出，血淋巴流失的症状。因此这种蜕皮是早熟、致死的蜕皮。即使有些幼虫到了末龄，可以形成畸形蛹，却不能正常羽化而死亡。而杜育哲等[3]于2002年用同系列早期产品RH-5992对棉铃虫（Helicoverpa armigera）4龄幼虫的蜕皮进行了研究，同样观察到了“双头囊”致死、后肠脱出和畸形蛹等现象。

斜纹夜蛾体壁可以区分出3个明显的结构，由外向内依次为上表皮+外表皮、中表皮+内表皮、真皮。与正常蜕皮相比，RH-2485处理后，幼虫体壁较对照有明显变化：上表皮+外表皮与真皮细胞之间形成大的间隙，真皮细胞层明显变薄。可以看出，皮细胞的形态、表皮序列的变化都和正常相似，但RH-2485处理后的真内皮变薄，新真皮增长缓慢，虫体不表现出蜕皮行为而死亡。用同系列早期产品RH-5849、RH-5992等处理甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[14]、云杉色卷蛾（Choristoneura fumiferana）[15]都观察到类似的现象和症状。说明新合成的蜕皮激素类似物RH-2485与早期产品RH-5849、RH-5992等一样，可诱导早期基因的表达，启动蜕皮，但该类化合物在昆虫体内不易降解，持续存在，抑制了部分后期基因的表达，从而导致不正常的、致死的蜕皮[5-6]。

參考文献

[1] 胡启豪，刘学术，马琼，等.保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响[J].华南师范大学学报（自然科学版），2017，49（4）：62-67.

[2] SONG G P，HU D K，TIAN H，et al.Synthesis and larvicidal activity of novel thenoylhydrazide derivatives[J].Scientific reports，2016，6：1-13.

[3] 杜育哲，郭世宜，王秀玲，等.新型非甾醇蜕皮激素类杀虫剂对棉铃虫幼虫蜕皮的影响[J].昆虫学报，2002，45（6）：748-752.

[4] SOLTANIMAZOUNI N，HAMI M，GRAMDI H.Sublethal effects of methoxyfenozide on reproduction of the Mediterranean flour moth，Ephestia Kuehniella Zeller[J].Invertebrate reproduction & development，2012，56（2）：157-163.

[5] 徐志红，李俊凯.双酰肼类昆虫生长调节剂的研究进展[J].江苏农业科学，2015，43（3）：5-10.

[6] ALI Q，HASAN M U，MASON L J，et al.Biological activity of insect growth regulators，pyriproxyfen，lufenuron and methoxyfenozide against Tribolium castaneum （Herbst）[J].Pakistan journal of zoology，2016，48（5）：1337-1342.

[7] 崔永涛，林佳，李广宏，等.RH-2485对斜纹夜蛾幼虫生长发育的影响[J].安徽农业科学，2018，46（4）：140-142.

[8] 丘雪红，韩日畴.冬虫夏草寄主蝠蛾天然饲料珠芽蓼对小菜蛾、斜纹夜蛾生长发育的影响[J].环境昆虫学报，2016，38（1）：54-60.

[9] 王容燕，马娟，李秀花，等.防治斜纹夜蛾高效药剂及复配配方筛选[J].农药，2017，56（8）：603-605.

[10] 陈其津，李广宏，庞义.饲养五种夜蛾科昆虫的一种简易人工饲料[J].昆虫知识，2000，37（6）：325-337.

[11] 暴学祥，郑一平，张恒山，等.CP包埋剂及其在昆虫体壁组织连续切片中的应用[J].科学通报，1999，44（7）：720-725.

[12] 郭郛.昆虫的激素[M].北京：科学出版社，1979.

[13] ZHANG X，ZHENG S.20hydroxyecdysone enhances the expression of the chitinase 5 via BroadComplex ZincFinger 4 during metamorphosis in silkworm，Bombyx mori[J].Insect molecular biology，2017，26（2）：243-253.

[14] JIA B T，LIU Y J，ZHU Y C，et al.Inheritance，fitness cost and mechanism of resistance to tebufenozide in Spodoptera exigua （Hübner） （Lepidoptera：Noctuidae）[J].Pest management science，2009，65（9）：996-1002.

[15] DOUCET D，FRISCO C，CUSSON M，et al.Diapause disruption with tebufenozide for earlyinstar control of the spruce budworm，Choristoneura fumiferana[J].Pest management science，2007，63（8）：730-736.