解糖类芽孢杆菌的鉴定及杀灭实验

肖琳 陈中

摘 要：通过对菌株鉴定及DNA序列分析，确定菌株为解糖类芽胞杆菌。采用实际应用中的高效消毒剂对其进行杀灭实验。且采用不同浓度，不同作用时间及温度对其进行对比实验，最后选择浓度为500ppm复方过氧乙酸消毒剂对其进行杀灭。

关键词：DNA序列分析；过氧乙酸复方消毒剂；解糖类芽胞杆菌

解糖类芽胞杆菌为生产用纯水中分离出来的菌株，且在生产用水中检出率较高。此菌细胞呈杆状，革兰氏染色阴性，在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，氧化酶阳性。经DNA序列分析为解糖类芽胞杆菌。为保证食品生产用水的质量，首先对它的属性进行研究，进而寻找能有效杀灭此菌的消毒剂和消毒条件。通过选择过氧乙酸复方消毒剂在实验室对解糖类芽胞杆菌进行了悬液定量杀菌试验。

鉴定

（1）菌落特征：将细菌菌株接种在MC营养琼脂板上35℃培养24小时，观察菌落，发现菌落蔓延扩散，呈油脂稍透明状，圆形，菌落淡黄色，表面干燥，无固定大小。在营养琼脂上无可溶性色素。[1]

（2）革兰氏染色：细胞呈杆状，革兰氏染色有时阳性，有时阴性，膨大胞囊内有椭圆形芽孢。

（3）触酶：阳性。

（4）耐高温：采用100℃热水用煮沸法30分钟以上才能将其杀死。

（5）DNA序列分析。

测序引物：1492R和27F

测序结果：

拉丁名：Paenibacillus glucanolyticus

中文名：解糖类芽胞杆菌

杀灭方法

2. 菌悬液制备

取纯的解糖类芽胞杆菌菌种接种于营养肉汤培养基中，置37℃培养18h-24h，再划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h-24h，挑取上述培养物中菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h-24h，取上述新鲜培养物用稀释液稀释，即制得菌悬液。

2. 消毒剂制备

消毒剂为复方过氧乙酸消毒剂，是以过氧乙酸为主要有效成分的消毒剂，含量为4.0%-5.2%（W/V）。最终配制的有效成分含量为500ppm。

2.3 中和剂

5g/L硫代硫酸钠、3.0%吐温-80和3g/L卵磷脂PBS。

2.4 中和剂选择试验

试验菌为解糖类芽胞杆菌，试验分组为：①消毒剂+菌液；②（消毒剂+菌液）+中和剂；③（消毒剂+中和剂）+菌液；④中和剂+菌液；⑤正常菌对照；⑥未接种菌的培养基对照。试验结果，以第6组不长菌，第3、4、5组组间菌数差不超过10%，第1组不长菌或长菌量远低于第2组，第2组长菌量超过100cfu/ml，其组间菌落数误差率不超过15%，表明所用中和剂及其浓度适宜。[2]

2.5 悬液定量杀菌试验

试验时，将0.5ml菌悬液先与0.5ml的小牛血清混合，加入4ml消毒液混合，作用至预定时间，取0.5ml混合液，加入4.5ml中和剂中，混匀。中和作用10分钟，取中和后的混合液1ml接种平皿，另取0.5ml加入4.5ml稀释液，混匀，吸取1ml接种平皿，并倾注营养琼脂TSA并混匀。于35℃培养箱培养48小时，计数菌落数，重复试验3次，计算杀灭率。

3 结果

3. 中和鉴定试验结果

结果表明，所选中和剂可有效中和最高试验浓度的消毒剂对解糖类芽胞杆菌的残余作用（表一）

3. 杀菌试验结果

试验温度在试验温度20±1℃条件下，按产品说明书选择杀灭芽胞杆菌最短作用时间15分钟。并在最短作用时间的0.5倍及1.5同时进行试验，经过3次重复试验证明，最低浓度500ppm，在作用时间15分钟后，对解糖类芽胞杆菌的平均杀灭对数值>5.00。

4 实际应用

4. 清洗

用热的纯水配制2%CIP-100溶液（碱性洗涤溶液），启动设备装置循环程序，让CIP-100溶液在设备和管道系统中循环不少于45分钟，去除管道中的有机物质或油类物质，排空CIP-100溶液，然后用热的纯水ICH2929冲洗设备和管道系统不少于10分钟。用冷的纯水配制1%CIP-200溶液（酸性洗涤溶液）在系统中循环不少于45分钟，为去除管道中的水垢，再用热的纯水冲洗设备和管道系统不少于10分钟，取水样检测pH值，直至冲水样达到中性。此清洗步骤可帮助去除管中的生物膜。

4. 消毒

用冷的纯水（室温即可）配制伏泰消毒液，使用浓度为500ppm，启动设备装置循环程序，让伏泰消毒液在设备和管道系统中循环不少于30分钟，排空伏泰消毒液，然后用热的纯水沖洗设备和管道系统装置至少10分钟，取冲洗水样到化学实验室检测pH。如果未达到中性，继续冲洗直至冲洗水的pH值为中性。

5 后续跟进

持续每周取水样，进行微生物检测，连续六个月内均未检出解糖类芽胞杆菌，证明此消毒方法的可行性。

6 讨论

过氧乙酸具有杀菌作用时间短，使用浓度低的优点，使用后分解快，无残留，不会残留有毒物质，不污染环境。该消毒液对铝有轻度腐蚀作用，对铜，不锈钢基本无腐蚀作用。[3]

参考文献：

[1]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.科学出版社，2001.2：57-58.

[2]卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].北京：中华人民共和国卫生部，2002：15-28.

[3]刘曾宁，王光建.消毒剂生产及应用[M].北京：化学工业出版社，2003.9：46.