富硒蛹虫草中有机硒的分析

陈尚龙，刘辉，张建萍，*，戴意强，魏云

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏徐州221018；2.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州221018）

Se是1种对人体健康有着重大意义的必需微量营养元素，它可以与人体内一些酶结合形成具有很强抗氧化能力的物质，从而增强人体的免疫力[1]。Se需要通过食物从外界摄入，平时食用的食物中Se含量极低，很难满足人体正常需要，导致缺Se现象较为普遍，严重威胁人体健康[2-3]。如何科学地补Se已成为研究热点。近年来，随着对富硒产品功能研究的深入，已经认识到高品质富硒产品不仅取决于硒的含量，还与硒的形态有着密切关联[4-8]。在人体内不同形态的Se有着不同的化学行为和生物活性[9-10]。相关研究报告表明，无机硒不易被人体吸收，生物活性低，具有一定毒性，摄入不当会引起慢性中毒；而经过生物转换的有机硒，易被人体吸收，毒性低，具有的生物学功能是由硒蛋白来调控和实现的[11-14]，因此与无机硒相比，有机硒更为重要。

本试验以实验室研制的富硒蛹虫草为研究对象。首先，参照DBS42/002-2014《湖北省食品安全地方标准富有机硒食品硒含量要求》制备出富硒蛹虫草总硒测定试样；其次，参照GB 1903.21-2016《食品安全国家标准食品营养强化剂富硒酵母》制备出富硒蛹虫草无机硒测定试样；然后，再使用高分辨-连续光源石墨炉原子吸收光谱法（high resolution-continuum source graphite furnace atomic absorption spectrophotometry，HR-CSGFAAS）[15-23]进行测定；最后，根据“有机硒含量（mg/g）=总硒含量（mg/g）-无机硒含量（mg/g）”计算出富硒蛹虫草中有机硒含量，为快速、准确检测食品中微量元素含量及其形态提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒蛹虫草：江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室研发的样品。

浓硝酸、高氯酸、φ（乙醇）=95%、Mg（NO3）2、Pd（NO3）2（均为优级纯）：国药集团化学试剂有限公司；Se标准溶液（1 g/L）：国家化学试剂质检中心；18.2MΩ·cm超纯水；氩气（纯度大于99.99%）；玻璃器皿均用φ（HNO3）=5%溶液浸泡24 h以上。

1.2 仪器与设备

ContrAA 700高分辨连续光源原子吸收光谱仪（配有MPE60自动进样器）：德国Analytik Jena公司；L550离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；CascadaTM实验室超纯水系统：美国Pall公司；FA-2004B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；220V-AC电子电炉（0～2 000W）：上海树立仪器仪表有限公司；移液器：德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 仪器工作参数

HR-CSGFAAS测定Se工作参数：分析谱线为196.026 7 nm，载气为高纯氩气，基体改进剂为Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液，基体改进剂添加体积为5μL，进样体积为20μL，灰化温度为1 100℃，原子化温度为2 200℃，原子化升温速度为1 500℃/s。

1.3.2 基体改进剂溶液的配制

用 φ（HNO3）=0.5%溶液溶解 0.1 g Pd（NO3）2和0.05 g Mg（NO3）2后转移至 100mL 容量瓶中，再用此溶液定容至刻度，配制成1 g/L Pd（NO3）2和0.5 g/L Mg（NO3）2混合溶液。

1.3.3 标准工作曲线的配制

用移液枪准确移取60μLSe标准溶液（1 g/L）置于100mL容量瓶中，再用φ（HNO3）=0.5%溶液定容至刻度，配制成质量浓度为0.6mg/L的Se标准使用液，再通过MPE自动进样器实现标准曲线质量浓度梯度为 0.03、0.09、0.15、0.30、0.45、0.60mg/L。

1.3.4 样品前处理

总硒测定试样制备（参照DBS42/002-2014）：准确称取0.5 g～2.0 g（精确至0.1mg）富硒蛹虫草粉末试样，置于150mL高筒烧杯内，加10.0mL混合酸（硝酸与高氯酸按体积比4∶1混合）及几粒玻璃珠，盖上表面皿冷消化过夜。次日于电热板上加热，并及时补加混合酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积2mL左右，切不可蒸干。冷却，再加5mL盐酸（6mol/L），继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，以完全将六价硒还原成四价硒。冷却，转移定容至50mL容量瓶中，同时做空白试验。

无机硒测定试样制备参照GB 1903.21-2016：准确称取1 g左右（精确至0.1mg）富硒蛹虫草粉末试样，置于50mL小烧杯中，加入25mLφ（乙醇）=95%，在磁力搅拌器中搅拌30min，使试样充分溶解，转移至100mL容量瓶中，用φ（乙醇）=95%定容至刻度，振荡、摇匀，静置于冰箱1 h。将定容后的溶液置于4 000 r/min条件下离心30min。同时做空白试验。

2 结果与分析

2.1 基体改进剂添加体积的优化

试验以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液为基体改进剂，基体改进剂的添加体积是影响Se吸光度的因素之一，为了最大限度地消除基体干扰，提高Se的吸光度。试验在固定其他参数条件下，只改变基体改进剂的添加体积，测定Se的吸光度，结果如图1所示。

图1 基体改进剂的体积对吸光度的影响Fig.1 Effectofm atrixm odifier volum eon absorbancy

由图 1 可知，以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液为基体改进剂能显著地提高Se的吸光度，这是由于不添加基体改进剂时，过高的灰化温度会导致Se挥发损失，使Se的吸光度降低。当添加体积＜5μL时，Se的吸光度随着基体改进剂添加体积的增大而增大；当体积≥5μL时，增加趋势趋于平缓。因此，试验选择基体改进剂最佳添加体积为5μL。

2.2 灰化温度的优化

灰化温度是影响Se吸光度的因素之一，过低的灰化温度无法使基体完全灰化，导致背景吸光度升高；过高的灰化温度会导致Se挥发损失，使Se的吸光度降低，重复性变差。试验在固定其他参数条件下，只改变灰化温度，测定Se的吸光度，结果如图2所示。

由图2可知，当灰化温度＜1 100℃时，Se的吸光度随着灰化温度的增大而增大；当灰化温度≥1 100℃时，Se的吸光度开始下降。因此，试验选择最佳的灰化温度为1 100℃。

2.3 原子化温度的优化

原子化温度也是影响Se吸光度的因素之一，过低的原子化温度无法使Se彻底原子化，导致其吸光度降低，吸附峰峰形变差；过高的原子化温度会减少石墨管的使用次数。试验在固定其他参数条件下，只改变原子化温度，测定Se的吸光度，结果如图3所示。不同原子化温度条件下，Se的吸收峰峰形如图4所示。

图2 灰化温度对吸光度的影响Fig.2 Effectof ashing temperatureon absorbancy

由图3可知，当原子化温度＜2 200℃时，Se的吸光度随着原子化温度的增大而增大；当原子化温度≥2 200℃时，Se的吸光度趋于稳定。由图4可知，当原子化温度为2 000℃和2 100℃时，Se的吸收峰峰形较差，拖尾现象明显；当原子化温度为2 200℃和2 300℃时，Se的吸收峰峰形较好，无明显拖尾现象。因此，试验选择最佳的原子化温度为2 200℃。

图3 原子化温度对吸光度的影响Fig.3 Effectof atom izing temperatureon absorbancy

图4 原子化温度对Se吸收峰的影响Fig.4 Effectof atom izing tem peratureon selenium absorption peak

2.4 标准工作曲线

通过ASpect CS软件设置Se的检测方法，将0.60mg/LSe 标准使用液、Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液、稀释适当倍数的空白溶液和待测样品溶液放入MPE自动进样器的对应位置，建立相应的测定序列，使用HR-CSGFAAS进行顺序测定。以Se的质量浓度为横坐标、Se的吸光度为纵坐标，经AS-pectCS软件绘制非线性标准工作曲线如图5所示。

图5 标准工作曲线Fig.5 Standard working curves

所得方程为A=（0.037 312 5+0.917 625 5c）/（1+0.304 683 9c），相关系数为 0.999 2，表明在 0～0.6mg/L范围内，Se的质量浓度与吸光度呈现良好的关系。

2.5 富硒蛹虫草中有机硒的测定

在最佳试验条件下测定总硒和无机硒的含量，根据“有机硒含量（mg/g）=总硒含量（mg/g）-无机硒含量（mg/g）”计算出富硒蛹虫草中有机硒的含量，结果见表1。

表1 富硒蛹虫草中有机硒的含量（n=3）Tab le1 The contentsof organic Se in selenium-enriched Cordycepsm ilitaris（n=3）

由表1可知，富硒蛹虫草总硒含量为1.407mg/g，无机硒含量为0.083mg/g，计算出有机硒含量为1.324mg/g，所占百分比为94.1%，这说明富硒蛹虫草含有丰富的有机硒，是补硒良品。

2.6 加标回收率试验

将一定体积Se标准溶液和富硒蛹虫草一起加入到烧杯或锥形瓶中，按1.3.4节进行操作，在最佳试验条件下进行测定，计算Se的加标回收率[24-25]，结果见表2。

表2 加标回收率（n=3）Table2 Recoveriesof Se in selenium-enriched Cordycepsm ilitaris（n=3）

由表2可知，总硒和无机硒的加标回收率分别为95.7%和94.0%，相对标准偏差＜4.5%，表明参照DBS42/002-2014和GB 1903.21-2016测定富硒蛹虫草总硒和无机硒，结果准确可靠，添加的Se标准溶液（无机硒）几乎全部在待测无机硒试样中。

3 结论

试验以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液为基体改进剂，通过试验优化出基体改进剂最佳添加体积为5μL，最佳灰化温度为1 100℃，最佳原子化温度为2 200℃。测定结果表明，富硒蛹虫草总硒含量为1.407mg/g，无机硒含量为0.083mg/g，计算出有机硒含量为1.324mg/g，所占百分比为94.1%，这说明富硒蛹虫草含有丰富的有机硒，是补硒良品。总硒和无机硒的加标回收率分别为95.7%和94.0%，相对标准偏差＜4.5%，表明参照DBS42/002-2014和GB 1903.21-2016测定富硒蛹虫草总硒和无机硒，结果准确可靠，添加的Se标准溶液（无机硒）几乎全部在待测无机硒试样中。

参考文献：

[1]王明洋,方勇,裴斐,等.硒对杏鲍菇营养品质和抗氧化酶活性的影响[J].食品科学,2016,37(11):208-213

[2]Zhang Z,Zhao P,Guo J,et al.The extraction of different solubility protein in selenium enriched peanuts and the analysis of their antioxidantactivity[J].Science&Technology of Food Industry,2012,33(4):323-326

[3]BodnarM,Konieczka P.Evaluation of candidate referencematerial obtained from selenium-enriched sprouts for the purpose of selenium speciation analysis[J].LWT-Food Scienceand Technology,2016,70:286-295

[4]李红卫,王开萍,吴娱,等.柱前衍生-反相高效液相色谱法研究富硒米曲霉中有机硒形态[J].食品科学,2015,36(22):137-141

[5]Mao G H,Ren Y,Li Q,et al.Anti-tumor and immunomodulatory activity ofselenium (Se)-polysaccharide from Se-enriched Grifola frondosa[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,82(10):607-613

[6]Wang Y D,Wang X,Wong Y S.Generation of selenium-enriched ricewith enhanced grain yield,selenium contentand bioavailability through fertilisation with selenite[J].Food Chemistry,2013,141(3):2385-2393

[7]Bo Y,WangD,WeiG,etal.Selenium-enriched Candidautilis:Efficient preparation with l-methionine and antioxidant capacity in rats[J].Journal of Trace Elements in Medicine&Biology,2012,27(1):7-11

[8]Gionfriddo E,Naccarato A,Sindona G,etal.A reliable solid phase microextraction-gas chromatography-triple quadrupolemass spectrometry method for the assay of selenomethionine and selenomethylselenocysteine in aqueous extracts:Difference between selenized and not-enriched selenium potatoes[J].Analytica Chimica Acta,2012,747(20):58-66

[9]Mahn A,Zamorano M,Barrientos H,etal.Optimization of a process toobtain selenium-enriched freeze-dried broccoliwith high antioxidantproperties[J].LWT-Food Science and Technology,2012,47(2):267-273

[10]LIU LIHANG,FAN WANLUN.Incomplete digestion FAAS-faes determination ofcalcium,magnesium and potassium in human footexuviae[J].Physical Testing and Chemical Analysis PartB:Chemical Analysis,2005,37(2):348-352

[11]Dong JZ,Ding J,Yu PZ,etal.Composition and distribution of the main active components in selenium-enriched fruit bodies of Cordycepsmilitaris,link[J].Food Chemistry,2013,137(1/4):164-167

[12]Zhang B,Zhou K,Zhang J,etal.Accumulation and speciesdistribution ofselenium in Se-enriched bacterial cellsof the Bifidobacterium animalis01[J].Food Chemistry,2009,115(2):727-734

[13]王欣,幸苑娜,陈泽勇,等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测富硒食品中6种硒形态[J].分析化学,2013,41(11):1669-1674

[14]杨洋,吴小勇,张湛,等.富硒灵芝发酵培养工艺及产物抗氧化能力研究[J].现代食品科技,2010,26(12):1349-1353

[15]Peronico V CD,Raposo JL.Ultrasound-assisted extraction for the determination ofCu,Mn,Ca,and Mg in alternative oilseed cropsusing flame atomic absorption spectrometry[J].Food Chemistry,2016,196:1287-1292

[16]Ozbek N,Baysal A.A new approach for the determination ofsulphur in food samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometer[J].Food Chemistry,2015,168(168):460-463

[17]Paz-Rodríguez B,Aboal-Somoza M,Bermejo-Barrera P.Application of High Resolution-Continuum Source Flame Atomic Absorption Spectrometry(HR-CSFAAS):Determination of traceelements in teaand tisanes[J].Food Chemistry,2015,170:492-500

[18]JSantos,M TOliva-Teles,CDelerue-Matos,etal.Multi-elemental analysis of ready-to-eat“baby leaf”vegetables usingmicrowave digestion and high-resolution continuum source atomic absorption spectrometry[J].Food Chemistry,2014,151(151):311-316

[19]Baysal A,Akman S.A practicalmethod for the determination ofsulphur in coal samples by high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry[J].Talanta,2011,85(5):2662-2665

[20]Ozbek N,Akman S.Method development for the determination of fluorine in toothpaste viamolecular absorption of aluminum mono fluoride using a high-resolution continuum source nitrous oxide/acetylene flame atomic absorption spectrophotometer[J].Talanta,2012,94(6):246-250

[21]Brandao GC,Jesus RM D,Silva EG PD,etal.Use of slurry sampling for the direct determination of zinc in yogurt by high resolution-continuum source flameatomic absorption spectrometry[J].Talanta,2010,81(4/5):1357-1359

[22]秦杰,陈尚龙,张建萍,等.微波消解-原子吸收法测定鸡精中金属元素[J].食品研究与开发,2014(22):63-67

[23]张建萍,陈尚龙,刘恩岐,等.微波消解-HR-CSAAS法测定几种调味品中的微量元素[J].现代食品科技,2013,29(6):1424-1427

[24]陈安徽,陈尚龙,巫永华,等.黄精酵素口服液中钙、铁和锌的形态分析[J].现代食品科技,2016,32(1):1425-1427

[25]陈琛,苏珂,陈贵堂,等.灰树花中铁的存在形态分析[J].食品科学,2013,34(22):189-192