大黄素甲醚调节miR-370诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

李燕 潘小平 王海霞 仝东蒙 王琛 朱丽达

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的侵袭性恶性肿瘤之一。因肝内转移和复发，在癌症导致的死亡原因中，男性排名第二，女性排名第六[1-2]。最近十年，发展中国家的HCC发病率和死亡率一直在增加[3]。据统计，我国2011年新增HCC患者355 595例，死亡322 416例[4]。由于目前常规治疗效果不理想，寻找新药已成为改善肝癌患者预后的迫切要求。MicroRNAs（miRNAs）是一类长约21～25个核苷酸的内源性非编码单链小RNAs，在多个生理活动中发挥重要作用，可以通过转录前调节靶基因mRNA的表达来影响细胞的增殖、凋亡和分化等[5]。越来越多的证据表明，异常调节miRNAs与不同的人类恶性肿瘤的发展和预后有关[6]。如miR-148b的异常低表达与HCC的不良结果有关[7]。miR-522水平升高预示着HCC患者的预后较差[8]。在HCC细胞中，miR-370通过抑制迁移和侵袭发挥其抑制转移的潜能[9]。有最新研究报道在体外增加miR-370表达会促进肝癌细胞的死亡[10]。然而，miR-370对HCC细胞生物学行为的影响机制尚不完全清楚。大黄素甲醚是药用植物大黄中的一种活性成分，已被用作泻药、保肝、消炎和抗菌药[11-12]。最近也有大黄素甲醚诱导细胞凋亡[13-14]、阻断细胞周期增殖[13]和抑制癌细胞转移[15]的报道。然而，大黄素甲醚在HCC中的作用机制尚未见报道。本研究旨在观察大黄素甲醚调节miR-370诱导HCC细胞的凋亡情况，并探讨其作用机制。

材料与方法

一、细胞系

人肝癌细胞SMMC7721和HepG2购自美国标准菌库，肝细胞系L-02购自上海生命科学研究院细胞资源中心。所有细胞系在37℃含5%CO2的加湿培养箱中，在含有4 mg/L谷氨酰胺、3.7 g/L碳酸氢钠、4.5 g/L葡萄糖和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。

二、实时定量PCR（qRT-PCR）

利用TRIzol试剂从培养的细胞中提取总RNA，通过高容量cDNA试剂盒获得cDNA，采用TaqMan PCR试剂盒和ABI 7500系统进行qRT-PCR。使用实时Taqman探针检测miR-370 mRNA在组织中的表达，miR-370在细胞和组织中的表达被规范化为U6。Sp1和DNA甲基转移酶1（DNMT1）的特异性引物分别购自生合生物科技有限公司和北京义翘神州生物技术有限公司。Sp1和DNMT1的mRNA表达被GADPH标准化，PCR结果分析采用ΔCt比较法。

三、CCK-8检测细胞活力

将密度为1×105/mL的SMMC7721和HepG2细胞在培养皿中培养24 h或48 h。分别用0、2.5、5、10 μmol/L的大黄素甲醚处理，然后向培养液中加入CCK-8溶液，再培养1 h。通过检测450 nm波长下的吸光度来计算活细胞数目。

四、流式细胞仪分析细胞凋亡情况

使用FITC-膜联蛋白V细胞凋亡试剂盒通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。将密度为1×106/mL的SMMC7721和HepG2细胞，用膜联蛋白-V-FITC和丙酸（PI）在黑暗中染色15 min，然后用流式细胞仪分析癌细胞凋亡情况。

五、Western blot分析

用RIPA缓冲液裂解从组织中分离出蛋白质，通过含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液从细胞中提取蛋白质。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。提取的总蛋白通过SDS-PAGE电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上，用特异性抗体检测，并用BandScan软件进行强度定量分析。

六、miR-370抑制或过表达

慢病毒构建的 miR-370 mimic、miR-370和miR-370抑制剂购自Qiagen公司。细胞接种到96孔板中，孵育过夜；然后转染miR-370 mimic、miR-con或miR-370抑制剂；通过qPCR分析转染效率。

七、Sp1和DNMT1过表达

使用阳离子脂质体3000的试剂分别转染Sp1和DNMT1过表达质粒。转染48 h后，用Western blot检测相应的蛋白表达水平，以此验证大黄素甲醚是否通过DNMT1调节miR-370的水平。

八、在HCC细胞中转染Sp1和DNMT1的siRNA

Sp1和DNMT1的siRNA寡核苷酸分别购自上海西宝生物科技有限公司和美国圣克鲁斯生物技术公司。siRNA序列和一个作为对照的干扰序列，分别独立插入质粒载体pGCsi-H1中。转染时，将对数生长阶段的细胞接种于6孔板中，并将转染细胞再孵育48 h，经Western blot检测和分析验证。

九、统计学分析

所有统计学分析均使用GraphPad Prism 6软件。数据描述为均数±标准差（x±s）格式，统计学比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大黄素甲醚降低HCC细胞的活力

5 μmol/L 和 10 μmol/L 的大黄素甲醚处理SMMC7721和HepG2细胞24 h和48 h均可造成细胞活力的降低，且随着浓度的增加降低的更明显。48 h存活细胞的数量显著低于24 h（图1）。大黄素甲醚能增加SMMC7721和HepG2细胞的凋亡比例，见图2。

二、HCC细胞中通过上调miR-370造成大黄素甲醚诱导型细胞凋亡

miR-370水平随大黄素甲醚的浓度依赖性地增加，见图3A。miR-370 mimic明显增强了miR-370的表达，而miR-370抑制剂明显降低了miR-370的表达，见图3B。转染了miR-370 mimic的HCC细胞类似阳性对照，显示上调miR-370与凋亡细胞数目明显增加有关（图3C）。且miR-370抑制剂在两组细胞系中均能明显降低大黄素甲醚诱导型细胞凋亡。

三、大黄素甲醚通过AMPK/Sp1/DNMT1信号调节miR-370的表达

图1 大黄素甲醚对肝细胞癌细胞活力的影响

图2 大黄素甲醚对肝细胞癌细胞凋亡的影响（**P＜0.01）

图3 HCC细胞中MiR-370介导的大黄素甲醚细胞凋亡诱导效应

大黄素甲醚处理可导致SMMC7721和HepG2细胞中DNMT1在mRNA和蛋白水平上的降低（图4A）。大黄素甲醚能抑制Sp1的表达，表明大黄素甲醚可能通过抑制Sp1的表达调节DNMT1水平（图4B）。此外，大黄素甲醚通过活化AMPK抑制Sp1的表达（图4C、4D），AMPK/Sp1信号能通过大黄素甲醚的作用下调DNMT1水平（图4E）。为了证实AMPK/Sp1/DNMT1参与到大黄素甲醚对miR-370的调节中，DNMT1和Sp1的表达使用靶shRNA或过表达质粒和AMPK抑制剂化合物C和AMPK活化剂AICAR。本研究结果清晰地表明大黄素甲醚通过AMPK/Sp1/DNMT1信号调节miR-370水平（图4F）。大黄素甲醚通过AMPK/Sp1/DNMT1信号上调miR-370，进而诱导细胞凋亡（图4G）。

图4 大黄素甲醚通过AMPK/Sp1/DNMT1信号调节miR-370的水平

讨 论

大黄素甲醚是从药用植物大黄和海洋衍生小孢子菌属真菌中提取的一种天然蒽醌类衍生物，首次报道是其对结肠癌和白血病发挥细胞毒性作用[16]。从此，大黄素甲醚对人类乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌和鼻咽癌的诱导细胞凋亡效应被发现[13-14]。而且，包括EMMPRIN[14]、6-磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶和Sp1[17]的几个分子靶点也已被证实。

miR-370在许多人类恶性肿瘤中异常表达，因此有人提出关于miR-370在人类恶性肿瘤发生和发展过程中作用的相反结果：miR-370可以作为一个癌基因或肿瘤抑制基因。例如，在实体肿瘤和血液恶性肿瘤中检测到miR-370的异常低表达[18-19]，表明miR-370是肿瘤抑制基因。胆管上皮癌细胞的体外实验也表明用miR-370 mimic转染能抑制细胞生长[20]。此外，研究发现miR-370的更新能使癌细胞对化疗重新敏感[21]。相反地，某些研究成果发现miR-370在癌细胞中扮演着致癌miRNA的角色。如miR-370在霍奇金肿瘤G401细胞系中的离体过表达与肿瘤增殖率的增加有关，这表明miR-370具有致瘤作用[22]。此外，miR-370通过直接调节FOXO1促进人类前列腺癌和胃癌细胞的生长[23-24]。还有研究发现miR-370高表达与乳腺癌患者低治愈率之间的关系[25]。

在HCC细胞中，miR-370通过抑制迁移和侵袭显示出其抑制肿瘤细胞转移的潜力[9]。Sun等[10]最新的研究报道表明体外增加miR-370的表达，可以促进肝癌细胞的死亡。Pan等[26]研究报道miR-370水平可以作为临床评价肝细胞癌患者预后的独立指标。本研究显示miR-370介导HCC细胞中大黄素甲醚的凋亡诱导作用，进一步支持了miR-370作为HCC肿瘤抑制因子的作用，与以前研究相一致。因为癌症表观遗传的改变导致某些促进甲基化作用的肿瘤抑制基因的沉默，因此表观遗传学的不稳定性在癌症的发生和发展中起主要作用[27]。除蛋白质外，表观遗传调控也在miRNAs的调控中起关键作用[28]。这种现象使DNMT转移到DNA中前5个碳原子上的催化酶，成为miRNAs的关键调控因子[29]。

在DNMT家族中，DNMT1被研究的最多，报道中发现其参与肿瘤的发生和发展[30]。在HCC的细胞中，DNMT1的异常表达增加可以促进HCC的恶性发展，并且与HCC患者的复发和低治愈率有关[31]。据报道DNMT1介导了乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）诱导的p16-INK4A基因启动子的超甲基化[32]。本研究结果显示HCC中DNMT1作为一个上游信号分子调控miR-370的表达，表明DNMT1可能通过调节miRNAs影响HCC细胞的生物活性，并支持DNMT1作为一个潜在的HCC治疗靶点。

Sp1是已被证实的哺乳动物细胞中转录因子之一，通过调节多种基因的表达在细胞进程中发挥调控作用。由于Sp1与几种基因启动子的富含GC的基序结合并诱导癌细胞的生长，它已被认为是癌症治疗中有希望的靶点[33]。最近研究发现DNMT1基因启动子中存在富含GC基序，表明DNMT1可能是Sp1的下游靶点[34]，并且发现一些天然化合物通过Sp1调节DNMT1的表达[35]。本研究结果也显示大黄素甲醚通过抑制Sp1来调节DNMT1的表达，与以往研究结果一致。

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