脑啡肽酶基因多态性与阿尔茨海默病及血管性痴呆的相关性研究

屈文英

阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease，AD)和血管性痴呆(Vascular Dementia，VD)是老年期痴呆最主要的两种疾病，近年来，随着人口老龄化的不断进展，两种疾病的患病人数呈现逐年增高的趋势[1]。两种疾病具体发病机制目前均尚不明确。就AD来说，β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)瀑布理论是目前影响范围最为广泛的学说之一，该学说认为Aβ生成和清除失衡是神经元变性和痴呆发生的起始因素[2-3]。近年来，还有研究发现Aβ失衡可能与VD的发病和进展也密切相关[4]。脑啡肽酶(Neprilysin，NEP)是一种位于细胞表面的Ⅱ型膜蛋白，可参与脑内Aβ的降解[5]。有研究发现NEP与AD的发病和进展密切相关，但目前关于NEP基因多态性与AD相关性的研究较少，且观点不一[6-8]，探讨NEP及其基因多态性与VD之间联系的研究更为罕见。因此，本研究通过比较AD患者、VD患者和正常老年人NEP基因多态性，为痴呆的防治提供理论依据，为临床提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2013年1月-2016年6月于本科门诊或(和)住院治疗的AD、VD患者纳入AD组和VD组。AD组和VD组患者均需经简易精神状态量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)及第4版美国精神医学协会精神疾病诊断与统计手册诊断为痴呆。AD组患者共138例，其中男56例，女82例，年龄64～81岁，平均年龄(75.4±8.5)岁，符合2011年美国神经病学、语言障碍和卒中老年性痴呆和相关疾病学会(NINCDS - ADRDA)很可能AD诊断标准，并排除由脑血管病、其他脑器质性或功能性精神神经疾病、严重全身性疾病引起的痴呆和假性痴呆，排除精神发育迟滞及老年人良性健忘症。VD组患者共57例，其中男27例，女30例，年龄63～80岁，平均年龄(73.5±8.1)岁，其诊断及排除标准参见文献[9]。参照AD组和VD组性别及年龄构成，从同期于本院体检部体检的无脑血管病病史且无认知功能障碍的健康老年人中随机选择150例作为对照组，其中男70例，女80例，年龄63～80岁，平均年龄(73.7±9.2)岁。所有入组人员均为汉族，彼此无血缘关系。本研究通过本院伦理委员会审核批准，所有入组人员均充分知情同意。

1.2 基因多态性检测

采集清晨空腹时外周静脉血5 mL，按照氯仿饱和酚法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)联合DNA直接测序法检测NEP基因rs989692位点和rs6776185位点多态性。采用Primer5.0及Oligo6.0软件设计引物并进行特性验证，引物由上海生共生物有限公司合成，其中rs989692位点上游引物：5’-CTCTGTGCCCCAGTTTCCTAAT-3’，下游引物：5’-TATCTTGCTCCAGTGGCTTCCT-3’； rs6776185位点上游引物：5’-CACAGAGCATTAGCAGCAGTTCCT-3’，下游引物：5’-ACAGCCCTTCTCCTGCACATAT-3’。PCR反应体系(25 μL)包括10×Buffer 2.5μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，模板DNA1 μL，剩余由灭菌蒸馏水补足，反应条件：95 ℃预变性4 min，然后按照95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s顺序循环30周期，最后72 ℃延长3 min，经1%琼脂糖凝胶电泳确定，对PCR产物直接测序。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件，计量资料均服从正态分布，计量资料以±s表示，2组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Dunnett-t检验；计数资料以构成百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律检验。采用多因素Logistic回归分析法评价各因素与缺血性脑卒中后继发性癫痫的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组基本临床特征比较

如表1，各组年龄、性别均无明显差异(P均>0.05)；AD组和VD组比较，MMSE评分无明显差异(P>0.05)；AD组和VD组MMSE评分与对照组比较均有明显差异(P均<0.05)。

表1 各组基本临床特征比较

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

如表2～3，各组NEP基因rs989692位点和rs6776185位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，其基因频率已达到遗传平衡，具有群体代表性。

表2 NEP基因rs989692位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验

表3 Nrf2基因rs6776185位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.3 基因型和等位基因分布频率

如表4，各组NEP基因rs989692位点基因型和等位基因分布频率均无明显差异(P均>0.05)。对于rs6776185位点AD组和VD组分别与对照组比较，AA基因型和A等位基因分布频率均明显增多(P均<0.05)。AD组与VD组比较，2组基因型和等位基因分布频率均无明显差异(P均>0.05)。

3 讨 论

有流行病学研究显示年龄大于80岁老年人，约有20%患有痴呆。近年来，随着生活和医疗水平的不断发展，我国乃至全世界逐步进入老龄化社会，罹患痴呆的患者人数不断增长[1]，AD和VD作为痴呆最主要的两种疾病，探索其遗传易感性，对痴呆的防治均有重要意义。Aβ对神经元和突触具有毒性作用，可破坏突触膜，导致神经细胞死亡，在局部形成“老年斑”，Aβ脑内沉积及“老年斑”形成是AD发病最重要的病理学特征之一。近年来不断有研究发现Aβ在脑血管病及VD的发病中也起到重要作用[2-4,10]。NEP作为体内降解Aβ最重要的降解酶之一，近年来成为该领域研究的热点。

NEP是一种含锌离子的细胞表面Ⅱ型膜蛋白，属于中性内肽酶M13家族中的一员，早在1995年Howell等[11]学者便发现NEP可能参与Aβ的降解；随后Iwata等[12]学者通过向实验大鼠海马注射NEP选择性抑制剂四氢噻吩证实了NEP对Aβ的降解作用。目前，越来越多的基础研究和临床试验支持NEP与AD发病和进展密切相关，但NEP基因多态性与AD发病相关性的研究较少，且结论不一，缺乏大样本的研究报道[6-8,13]。本研究在前期通过检索中外相关文献，发现NEP基因多态性位点存在多个，包括rs989692C/T、rs6776185A/G、rs3736187A/G、rs1836915T/C、-204G/C、159C/T等[13-15]，但目前研究结果发现可能与AD发病相关的位点不多，且少有研究取得重复验证结果，甚至部分研究彼此矛盾，究其原因，笔者认为可能包括以下几点：①各研究AD诊断标准不一致，目前关于AD诊断多采用NINCDS - ADRDA制定的很可能AD的诊断标准，该标准多以临床症状为依据，本身特异性较差，容易导致选择偏倚，且该标准不断进行更新，采用不同版本的诊断标准，必然导致各研究在患者选择上即存在较大差别；②缺少大样本量研究报道。一方面样本量不足可能导致研究检验效能降低，导致未出现阳性结果；另一方面不利于进一步按照危险因素进行分层，探讨NEP基因多态性的作用；③AD是一种多基因共同作用的疾病，探讨单一位点多态性对AD发病的影响，忽视了基因的相互作用，遗落了其他可能位点的功能；④可能不同种族使研究结果存在差异。NEP基因多态性与VD关联性研究鲜有报道，多数研究通过证实NEP对Aβ具有降解作用，而Aβ参与VD发病，而间接推测NEP基因多态性与VD发病存在关联[16-17]。

表4 NEP基因型和等位基因分布频率

注：Ⅰ为AD组与VD组比较；Ⅱ为AD组与对照组比较；Ⅲ为VD组与对照组比较

rs989692C/T和rs6776185A/G是目前研究较多的2个位点，但同样国内外报道的研究结果也不尽相同。本研究结果显示3组患者rs989692位点基因型和等位基因分布频率差异无统计学意义；对于rs6776185位点，AD组和VD组同对照组比较，AA基因型和A等位基因分布频率均显著增加，但(AA+AG)基因型差异无统计学意义，提示NEP基因rs6776185位点AA纯合子基因型可能与AD及VD发病相关。本研究同时比较AD组和VD组患者rs6776185位点基因型和等位基因分布频率，结果显示差异无统计学意义，再次提示Aβ在两种疾病发病中可能均扮演重要角色，NEP可通过降解Aβ干预AD、VD发病。

综上所述，NEP基因rs6776185位点突变和AD及VD发病相关。然而，该研究也存在诸多不足之处，目前关于NEP基因多态性对AD、VD发作的确切作用机制和分子功能均未明确，需要进一步从研究方法、研究对象选择等方面做出更为统一的标准，完善研究结果。另外，NEP基因多态性与其他基因以及其他作用因素相互作用的具体机制也仍需进一步研究。

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