丁葵草提取物对小鼠急性炎症抑制作用的研究

陈秀英，张宇晨，徐向坤，冯雪建

(郑州大学 药学院，国家药物安全性评价研究中心，药物关键制备技术教育部重点实验室，河南 郑州450001)

炎症是肿瘤、心血管疾病、内分泌等众多疾病的病变基础[1-5]，临床上多用非甾体类抗炎药和肾上腺皮质激素类药物进行治疗，虽然效果良好，但不良反应多。很多传统中药具有良好的抗炎效果，且副作用较少，从天然药物中开发抗炎药物逐步受到人们的重视。

丁葵草别名人字草、丁贵草、二叶人字草等，为豆科丁葵草属丁葵草[Zorniadiphylla(L.) Pers]的干燥全草。丁葵草主要有效成分包含黄酮苷、异黄酮、酚类、氨基酸等，具有清热解毒、祛淤、利尿和抗肿瘤作用。临床可用于感冒、痢疾、黄疸、咽喉炎、乳腺炎等[6-7]，目前未见丁葵草对急性炎症作用的报道。本文旨在探讨丁葵草对小鼠急性炎症发生发展的作用，为研究开发新的抗炎药物和丁葵草的临床应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

旋转蒸发仪(河南智诚科技发展有限公司)；电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；全自动脱水机、组织包埋机、切片机、染色封片一体工作站、图像采集系统(均购自德国徕卡有限公司)。伊文思蓝(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号A1309044)；复方醋酸地塞米松凝胶(江西吉安三力制药有限公司，批号151006)；醋酸地塞米松片(福州海王福药制药有限公司，批号1702220)。

1.2 实验动物

清洁级昆明种小鼠90只，雌雄各半，体质量18～22 g，购自河南省实验动物中心，合格证号41003100004497。

1.3 实验药物

丁葵草提取物的制备[8-9]：将丁葵草全草50 ℃干燥，粉碎，过50目筛，称重，加12倍(m/V)量的40%乙醇，90 ℃水浴回流提取1 h，重复3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩至含原生药1 g·mL-1，用去离子水另配成每mL含0.33 g和0.11 g原生药的药剂，分别标记为丁葵草高、中和低剂量提取液，置4 ℃冰箱备用。

1.4 丁葵草对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

取30只小鼠，随机分成5组：动物模型组，阳性药物(地塞米松)组，丁葵草高、中、低剂量组。每组6只，雌雄各半。本试验采用灌胃给药，灌胃体积0.2 mL·10 g-1，阳性药物以0.5%的羧甲基纤维素钠溶液混悬，用量1.17 mg·kg-1；丁葵草高、中、低剂量组分别给予上述制备的不同剂量提取液；模型组灌胃给予等体积生理盐水，连续5 d，每天1次。实验期间小鼠自由饮水采食。采用腹腔染料渗出法，参照文献[10]方法于末次给药30 min后每只动物尾静脉注射2%伊文思蓝生理盐水溶液0.1 mL·10 g-1，随即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，20 min后颈椎脱臼法处死小鼠。用5 mL生理盐水冲洗腹腔，洗液700g离心5 min，取上清，酶标仪检测上清液在590 nm波长处吸收值(D)，以此表示色素渗出率，并计算毛细血管通透性的抑制率。

1.5 丁葵草对二甲苯致小鼠耳片肿胀的抑制作用

实验动物分组同上。参照文献[11]方法用微量进样器吸取20 μL二甲苯，均匀涂抹在各组小鼠右耳内外两侧，左耳涂以等体积蒸馏水作为对照。30 min后给药，除模型组动物右耳涂抹生理盐水外，其余各组动物右耳均匀涂抹相应药物，各组动物左耳均涂抹等体积生理盐水，阳性药物选择复方醋酸地塞米松凝胶。用药1 h后颈椎脱臼法处死小鼠，沿耳郭基线剪下双耳，分别在左右耳相同部位用9 mm打孔器打下耳片，立即称重，以左右两耳片质量差值表示肿胀度，并与模型组比较计算耳片肿胀抑制率。

1.6 丁葵草对角叉菜胶致小鼠足肿胀的抑制作用

动物分组和用药同上。参照文献[12]方法于最后一次给药30 min后，将30 μL 1%(m/V)角叉菜胶注射于小鼠左足跖皮下，右侧注射等体积生理盐水作为对照。用药4 h后处死小鼠，沿踝关节下缘剪下左右两足，准确称量，计算肿胀度及肿胀抑制率。

将足趾沿正中矢状面切开，一部分组织称重，加9倍量(m/V)生理盐水，剪碎，室温浸泡2 h，1 400g离心5 min，取上清液200 μL加入2 mL 0.5 mol·L-1氢氧化钾-甲醇溶液，50 ℃水浴20 min，吸取200 μL加于96孔板，用酶标仪检测278 nm波长处吸光度(D)值，用D值代表炎症部位PGE2的含量[13]。另一部分足用4%甲醛溶液固定，HE染色，用徕卡显微镜及图像处理系统对足趾切片进行观察及采集，观察组织病理变化。

1.7 数据处理及统计学分析

应用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析，所得数值均以均值±标准差(Mean±SD)表示。多样本均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA法)，组间用LSD法两两比较，检验水准 α=0.05。

2 结果与分析

2.1 丁葵草对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与动物模型组相比，地塞米松组和丁葵草高剂量组在急性炎症发生时能极显著地抑制小鼠腹腔毛细血管通透性的增加(P<0.01)，丁葵草中剂量组亦可使小鼠腹腔毛细血管通透性显著降低(P<0.05)，丁葵草低剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性虽有所下降，但差异不具有统计学意义(表1)。

2.2 丁葵草对小鼠耳片肿胀的抑制作用

与模型组相比，丁葵草高剂量组和地塞米松组均可显著降低二甲苯所致的小鼠耳肿胀的发生率(P<0.01)，且二者对小鼠耳片肿胀的抑制效果相当。与模型组相比，丁葵草中剂量组亦可显著降低二甲苯所致的小鼠耳肿胀的发生(P<0.01)，但肿胀抑制率较高剂量组和地塞米松组差。丁葵草低剂量组未见对小鼠耳片肿胀有明显抑制作用。结果显示，随丁葵草提取液浓度的下降，其对耳片肿胀率抑制效果降低，呈剂量依赖性，结果见表2。

2.3 丁葵草对小鼠足肿胀的抑制作用

2.3.1 小鼠足肿胀的测定与分析

与模型组比较，地塞米松组和丁葵草高、中剂量组对小鼠足肿胀有极显著的抑制作用(P<0.01)；丁葵草低剂量组对足肿胀无显著性抑制作用。该结果与其对足炎症部分PGE2渗出抑制结果(以D278值表示)相符，结果见表3。

2.3.2 小鼠足肿胀部位病理学改变

和正常足趾(图1-A)相比，模型组小鼠足趾血管充血，皮下结缔组织及肌间水肿，且有大量中性粒细胞浸润，表现为急性化脓性炎症(图1-B)。与动物模型组相比，地塞米松及丁葵草高剂量组炎性细胞渗出明显变少，水肿减轻(图1-C，图1-D)。丁葵草中、低剂量组主要表现为炎性细胞渗出减少，水肿差异不明显，炎症程度明显有所缓解，见图1。

表1 丁葵草对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响Table 1 Effects of Zornia diphylla (L.) Pers on peritoneal capillary permeability in mice induced by acetic acid

与动物模型组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)；“—”指没有数据。下同。
In comparison with the model group，* represents significant difference (P<0.05)，** represents extremely significant difference (P<0.01), “—” indicates no data available. The same as below.

表2 丁葵草对二甲苯致小鼠耳肿胀率的影响Table 2 Effects of Zornia diphylla (L.) Pers on ear swelling of mice induced by xylene

表3 丁葵草提物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响Table 3 Effects of Zornia diphylla(L.) Pers on paw swelling of mice induced by carrageenan

A，正常足；B，动物模型组；C，阳性药物对照组；D，丁葵草高剂量组；E，丁葵草中剂量组；F，丁葵草低剂量组。HE染色，100 ×。A，Normal foot; B，Animal model group; C，Dexamethasone group; D，Zornia diphylla (L.) Pers high dose group; E，Zornia diphylla (L.) Pers middle dose group; F，Zornia diphylla (L.) Pers low dose group. HE staining，100 ×.图1 各组小鼠足HE染色结果Fig.1 HE staining of paw in each group

3 讨论

炎症是具有血液循环的活体组织对损伤因子所产生的防御性反应，是临床常见的病理过程。炎症发生的关键环节是炎症部位的血管反应，损伤因子可引起炎症部位毛细血管充血扩张，通透性增加，中性粒细胞趋化、游走至炎症部位，释放出PGE2等多种炎性介质。

丁葵草味甘、性凉，主要有效成分包括黄酮类、酚类、氨基酸类等，临床主要用于感冒、咽喉炎、乳腺炎等，但单独针对该药的研究较少。本实验以经典的炎症模型来研究丁葵草提取物的抗炎作用。

腹腔染料渗出法是研究药物抗炎作用常用的方法。低浓度醋酸具有强烈的致炎作用，可导致小鼠腹腔组织毛细血管通透性的增加，可用染料渗出率来表示毛细血管通透性。本试验结果显示，腹腔注射醋酸后小鼠腹腔色素渗出率明显增加。给予丁葵草提取液和地塞米松后，与模型组相比，给药组染料(伊文思蓝)的渗出率均明显降低，差异具有统计学意义(地塞米松和丁葵草高剂量组P<0.01，丁葵草中剂量组P<0.05)，其中丁葵草高剂量组抑制色素渗出率的作用与地塞米松相同，且具有一定剂量依赖性。

二甲苯是常用的化学致炎物，可诱导组胺、激肽、PGE2等炎性介质的释放，导致耳片局部充血、水肿、渗出等一系列急性炎症反应。本试验结果显示，涂抹二甲苯后，小鼠耳郭肿胀明显。丁葵草提取液高、中剂量组和地塞米松均能显著抑制二甲苯引起的小鼠耳郭肿胀炎症反应(P<0.01)，对肿胀的抑制率具有一定的剂量依赖关系。丁葵草高剂量组对耳郭肿胀的抑制作用与地塞米松相同。

角叉菜胶亦是急性炎症模型的良好致炎剂，给小鼠足内注射角叉菜胶可出现局部毛细血管扩张，血管通透性增加，渗出、水肿等一系列类似于人体急性炎症的反应，并诱导PGE2等一系列炎症因子的生成[14-17]。PGE2是强效扩血管物质，并协同其他活性物质参与血管渗漏水肿、疼痛等炎症反应[18]。本实验结果显示，注射角叉菜胶后小鼠足部即开始发生炎症并肿胀，丁葵草高剂量和地塞米松组均可显著抑制角叉菜胶所致的小鼠足肿胀，降低炎症部位PGE2的含量(P<0.01)。病理结果显示，丁葵草提取物可显著降低炎症部位的水肿程度和炎性细胞的渗出，与上述炎症模型数据一致。

综上，丁葵草提取液对炎症的发生有明显的抑制作用，且具有一定的剂量依赖性，该作用可能与抑制炎症部位PGE2的产生有关，实验证明丁葵草高剂量组与地塞米松组抗炎效果相近。地塞米松为甾体类抗炎药，虽然抗炎作用较强，作用广泛，但不良反应较多，给药时间较长时动物出现皮毛光泽度差，体重减轻等症状。在给药过程中，未见丁葵草提取液对小鼠有明显毒性作用。故丁葵草提取液在相同药效时不良反应较低，本试验为寻找安全有效的抗炎药物提供了试验依据。

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