硫化物对栉孔扇贝线粒体的损伤研究*

关 杨 王宇翔 毕愿坤 葛 顺 张立涛

（济宁医学院生物科学学院 山东日照 276826）

硫化物是含有-2 价硫离子化合物的统称，在水环境中通常以H2S、HS-和S2-3 种形式存在，可互相转化［1］。虽然近20年来研究发现一定浓度硫化物在动物体内神经调节，血管张力调节及生成，氧化应激细胞的保护和抗炎症等方面发挥着重要作用［2］，但是由于其可以与线粒体中的复合体Ⅳ即细胞色素c 氧化酶中aa3 亚基中的血红素卟啉环铁离子可逆性地结合，进而阻止氧气与其结合，中断线粒体呼吸链的电子传递，导致ATP 的耗尽和乳酸的积累，因而对生物体产生毒害［3］。在水产养殖过程中，硫化物主要通过硫酸盐的异化还原过程及有机质被微生物分解产生［4］，对水产养殖生物具有很强的毒性，其毒性研究主要集中在对虾类生物中［5-7］，但是对于贝类生物中涉猎很少。本研究以我国北方主要养殖贝类栉孔扇贝作为研究对象，通过测定硫化物暴露下栉孔扇贝各组织的线粒体活力、膜肿胀度、线粒体超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）含量，进而确定硫化物对其线粒体的损伤，为深入了解硫化物暴露对扇贝线粒体的影响提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及硫化物应激处理

1）实验动物。栉孔扇贝于2016年4月购买于日照市秦楼水产市场，产地为日照近海潮间带。实验室通气暂养1 周（暂养水温度18℃，pH7.9，盐度30）后，选择活力旺盛、大小相近的个体进行硫化物处理。

2）材料处理。在含有过滤海水的封闭大烧杯内采用1.7 mg/L 硫化物处理栉孔扇贝，6 h 后对栉孔扇贝的组织（外套膜、贝壳肌和肝胰腺）取样。

1.2 实验方法

1）线粒体提取。剪取栉孔扇贝各组织，滤纸吸干水分后称重（0.7 g 以上），4℃条件下采用差速离心法制备线粒体［8］。

2）线粒体活力测定。取新鲜制备的线粒体悬液100 μL，加入酶标板微孔中，加入40 μL 四甲基偶氮唑盐（5 g/L），30℃继续孵育30 min，再加入100 μL 异丙醇20 min 后在酶标仪570 nm 测定吸光度，OD570值大小表示线粒体活力。

3）线粒体膜肿胀度测定。在4℃放置的反应缓冲液（250 mmol/L 蔗糖、5 mmol/L KH2PO4、3 mmol/L琥珀酸钠、pH7.2）中加入线粒体悬液，调整线粒体蛋白含量为0.5 mg/mL，分光光度计540 nm 处测定吸光度（OD540），反应条件保持25℃恒温［9］。

4）线粒体超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定。设置空白管和自氧化管，各加入4.5 mL Tris-HCl（50 mmol/L）。自氧化管再加入10 μL 邻苯三酚（50 mmol/L），迅速摇匀，立即倒入1 cm 比色杯中，以空白管调零，在325 nm 波长处测定吸光度（A）值，每隔30 s 读数一次，测定4 min 内每分钟吸光度（A）的变化A=A/min。随后样品管取代自氧化管，样品管内先加入10 μL 线粒体悬液，再加入10 μL 邻苯三酚。其余步骤与邻苯三酚自氧化速率的测定相同［10］，其计算公式如下：

5）线粒体丙二醛(MDA)含量测定。采用丙二醛测定试剂盒（南京建成）测定线粒体中MDA 的含量，测定单位表示为nmol/mg.prot。

6）数据处理。所有数据结果均以平均值±标准误的形式表示，在SPSS 18.0 统计分析软件中利用t 检验进行组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 硫化物对线粒体活力的影响 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的四甲基偶氮唑盐还原为难溶于水的紫色结晶物，酸性异丙醇、十二烷基硫酸钠（SDS）或二甲亚砜（DMSO）均能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色的深浅与所含的量成正比，因此可根据570 nm 测定的吸光度大小间接反映线粒体活力。结果如图1所示，在对照组中，肝胰腺、外套膜和贝壳肌的OD570分别为0.83、0.69 和0.64；硫化物处理组线粒体活力分别下降了17.5%，36.2%和31.3%，均与对照组相比存在显著性差异（P＜0.05）。外套膜和贝壳肌能够与海水中的硫化物直接接触，因此降幅较大，均超过了30%，而肝胰腺位于扇贝内部，降幅较少。但综合来说，硫化物可以显著降低线粒体的活性。

2.2 硫化物对线粒体肿胀度的影响 线粒体膜上存在通透行转运孔道（PTP），其开放会导致线粒体内膜通透性增加，使线粒体基质呈现高渗状态，水渗透内流进而导致线粒体膨胀。因此可通过线粒体的肿胀程度推测PTP 的开关情况，结果如图2所示，在硫化物处理组中，3 个组织的线粒体在540 nm 的吸光值均显著性地降低了40%以上（P＜0.05），表明线粒体肿胀度变大，暗示线粒体通透性转变孔道开放明显。线粒体通透性转运孔道开放常常伴随ATP 耗竭、线粒体膜去极化、溶酶体破坏等，也可能导致细胞色素C 释放，从而对生物体造成损伤［11］。

2.3 硫化物对线粒体SOD 的影响 SOD 是生物体内最重要的抗氧化酶，其最主要的功能是去除体内产生的氧自由基。线粒体是氧自由基产生的重要部位，对其内部SOD 活性的测定可有效评估其体内氧自由基的活性。SOD 的酶活测定结果如图3所示，肝胰腺、外套膜和贝壳肌中SOD 的酶活分别达到23.8 U/mg.prot、19.9 U/mg.prot 和22.7 U/mg.prot，而在硫化物组SOD 酶活分别降到18.8 U/mg.prot、16.3 U/mg.prot、13.7 U/mg.prot，与对照组相比出现了显著性的差异（P＜0.05），该结果显示线粒体中氧化与抗氧化动态平衡可能被打破，导致活性氧不能被有效地清除，从而使线粒体产生不可逆转的氧化损伤［12］。

2.4 硫化物对线粒体MDA 含量的影响 MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量越高表明脂质过氧化的程度越强，生物膜的损伤程度就越大。研究结果（图4）显示在硫化物处理组中，肝胰腺、外套膜和贝壳肌中分别达到了2.26 nmol/mg.prot、2.64 nmol/mg.prot 和2.55 nmol/mg.prot，远 远 高 于对照组，存在显著性差异（P＜0.05）。丙二醛含量的增加可能会导致线粒体DNA 的损伤［13］，破坏线粒体膜结构［14］从而对线粒体造成不可逆转的伤害。

3 结论

栉孔扇贝经1.7 mg/L 硫化物暴露，各组织线粒体的通透性转变孔道开放明显，肿胀度增大；SOD 酶活降低，线粒体产生的活性氧不能有效清除；MDA 含量增加，影响线粒体的膜结构；线粒体结构产生损伤，线粒体活力显著降低。