M2型巨噬细胞在卵巢癌患者腹膜内肿瘤血管生成中的作用

降礼均

（内江市第二人民医院，四川 泸州 641000）

卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤。该病起病较为隐匿，大多数该病患者在就诊时已处于病程的晚期[1]。近年来的研究表明，卵巢癌患者体内M2型巨噬细胞的浸润数量与其预后存在密切的关联[2-3]。在本次研究中，笔者通过对卵巢癌患者腹水中M2型巨噬细胞和内皮血管的相关性进行研究，探讨M2巨噬细胞在卵巢癌患者腹膜内肿瘤血管生成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

人单核白血病细胞株、EA.hy926人脐静脉细胞融合细胞株由上海中科院提供；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培养液、平衡盐溶液（HBSS）及细胞培养基RPMI 1640由GIBCO公司提供；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）试剂由Sigmg公司提供；结晶紫染色试剂由碧云天生物技术公司提供；Transwell迁移小室由Corning公司提供；酶联免疫吸附实验（ELISA）的试剂盒由R&D公司提供；Matrigel基质胶由BD公司提供。

1.2 方法

1.2.1 进行细胞培养 取EA.hy926细胞，将其放入浓度为10%的FBS-RPMI 1640培养液中，然后将该培养液置于37℃的培养箱中，待细胞生长至对数期后对其进行消化收集。

1.2.2 进行细胞分化 将浓度为10%的FBS-RPMI 1640培养液重悬细胞至1×106个/ml，向其中加入PMA试剂，将其浓度调整为320 nmol/L后刺激24 h，使细胞分化为巨噬细胞样细胞（TAP）。待细胞贴壁后，去除上清液，使用盐酸缓冲盐溶液（PBS）对细胞进行充分的润洗，然后向其中加入浓度为10%的FBS-RPMI 1640培养液进行24 h的培养，再次去除上清液，并使用无血清的FBS-RPMI 1640培养基进行24 h的刺激培养。收集上清液，将其作为条件培养基（PMAr CM）。

1.2.3 进行巨噬细胞分离 取7例卵巢癌患者的腹水（在其进行手术的过程中用无菌技术进行采集）。对腹水样本进行常规的离心处理（转速为1200 r/min，处理时间为15min），收集细胞沉淀，然后用Ficoll密度梯度法（转速为2000 r/min，处理时间为20 min）收集中间层单核细胞。用HBSS对中间层单核细胞进行重悬后，再对其进行离心处理，然后用浓度为5%的FBS-RPMI 1640对其进行重悬，将其种植在24孔板上，种植的密度为每孔1×106。将24孔板在培养箱内静置4 h，使细胞贴壁，然后用经过预热的HBSS对细胞进行3次润洗，去除悬浮细胞。向培养箱中加入浓度为10%的FBS-RPMI 1640培养液，进行24 h的静置培养后，收集上清液，将其作为条件培养基（M2 CM）。

1.2.4 进行内皮细胞增殖能力（OD值）、迁移数目及肿瘤血管生成数量检测 将生长至对数期的EA.hy926细胞种植在96孔板上，静置8 h，待细胞贴壁后，去除上清液，向其中加入DMEM培养液，并对细胞进行12 h的同步处理，使参与实验的所有细胞均处于相同的增殖时相。将细胞分别加入以下四组培养基中，并进行48 h的培养：1）DMEM培养基组，将其作为参考组。2）M2 CM组（即M2巨噬细胞的无血清培养上清），将其作为A组。3）PMAr CM 组（即TAP细胞的无血清培养上清），将其作为B组。4）腹水组（在术中收集卵巢癌患者的腹水，经离心处理、清除沉淀及培养后，取上清液待检），将其作为C组。分别采用结晶紫染色、Transwell小室迁移及小管样结构形成实验对上述四组培养基中内皮细胞的OD值、迁移数目及小管形成的数量进行检测，并对比检测的结果。

1.2.5 进行VEGF及IL-8含量检验 用ELISA法对上述四组培养基中VEGF及IL-8的分泌情况进行检验，对比这四组培养基中VEGF及IL-8的含量。

1.3 统计学分析

将本次研究中的数据均纳入SPSS20.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组不同的培养基中内皮细胞的OD值、迁移数目及小管形成数量的对比

与参考组相比，A组、B组及C组内皮细胞的OD值、迁移数目及小管形成的数量均较高，P＜0.05。详见表1。

表1 四组不同的培养基中内皮细胞的OD值、迁移数目及小管形成数量的对比 （ ±s）

表1 四组不同的培养基中内皮细胞的OD值、迁移数目及小管形成数量的对比 （ ±s）

注：a与参考组相比，P＜0.05。

组别 OD值 迁移数目 小管形成数量A组 0.195±0.001a 85.02±1.98a 11.74±0.53a B 组 0.211±0.012a 72.77±6.51a 11.63±0.68a C 组 0.227±0.013a 144.98±10.62a 10.31±0.79a参考组 0.168±0.004 10.24±0.31 5.09±1.05

2.2 四组不同的培养基中IL-8及VEGF分泌量的对比

A组、B组培养基中的EA.hy926细胞分泌IL-8、VEGF的量均明显高于参考组，C组培养基中的EA.hy926细胞分泌IL-8的量也高于参考组，P＜0.05。不过，C组培养基中的EA.hy926细胞分泌VEGF的量与参考组相比，P＞0.05。详见表2。

表2 四组不同的培养基中IL-8及VEGF分泌量的对比 （ ±s）

表2 四组不同的培养基中IL-8及VEGF分泌量的对比 （ ±s）

注：a与参考组相比，P＜0.05。

指标 培养基 参考组 A组 B组 C组IL-8（ng/L） M2 CM 10.34±5.36 88.62±24.68a 86.76±2195a 36.74±15.62a PMAr CM 104.34±25.74 1673.14±267.61a 1527.62±229.75a 684.62±96.36a VEGF（ng/L） M2 CM 9.97±4.29 34.62±15.62a 1374.62±184.74a 12.36±5.16 PMAr CM 111.64±19.65 486.67±42.98a 1112.36±59.74a 168.34±24.62

3 讨论

巨噬细胞是肿瘤组织微环境中的一种非常重要的炎症细胞，其含量约占瘤间质炎症细胞总量的30%～50%[4]。该细胞来自外周血单核细胞，可在特定的微环境下分化成M2型巨噬细胞，且可释放IL-8、IL-4、TNF-a、EGF、IL-10及TGF-β1等多种因子及基质金属蛋白酶[5-6]，故其在肿瘤的进展中具有重要的作用。肿瘤血管生成是指在各种因子的刺激和诱导下，肿瘤组织中成熟血管的内皮细胞发生增殖、游走，并生成小血管，从而加快肿瘤的侵袭与转移。而内皮细胞的迁移和增殖是小血管生成的基础。

本次研究的结果显示，A组、B组、C组内皮细胞的OD值、迁移数量及小血管的生成数量均高于参考组，P＜0.05。这说明，M2型巨噬细胞可提高内皮细胞的增殖、迁移能力及肿瘤血管的生成能力。而且，A组、B组培养基中的EA.hy926细胞分泌IL-8、VEGF的量均明显高于参考组，C组培养基中的EA.hy926细胞分泌IL-8的量也高于参考组，P＜0.05。这说明，M2巨噬细胞可通过增加IL-8及VEGF的分泌量来加快肿瘤血管的生成。

综上所述，卵巢癌患者腹水中的M2型巨噬细胞可通过调控内皮细胞分泌IL-8及VEGF等促血管生成因子，增加内皮细胞的增殖、迁移能力和肿瘤血管的生成能力，从而促进患者腹膜内肿瘤血管的生成。这一研究结果有助于临床上进一步了解卵巢癌患者腹膜微环境中的炎症细胞和肿瘤血管生成的相互作用，从而为开展卵巢癌的靶向治疗提供依据。

参考文献

[1]王晨旭,王丽丽,杨艳芹,等.卵巢癌、成熟型畸胎瘤与正常血液样本中挥发性组分的研究[J].分析化学,2015,43(6):919-923.

[2]宋玉霞,赵涛,王宏卫,等.卵巢癌腹水中不同肿瘤相关性巨噬细胞亚型IL-10、IL-12表达的差异[J].河北医科大学学报,2017,38(6):676-679.

[3]李乔,尹如铁,周乐,等.IL-10免疫黏附素和肿瘤相关巨噬细胞对卵巢癌侵袭性的研究[J].华西药学杂志,2017,32(3):257-259.

[4]柯星,张淑平,吴梦,等.肿瘤相关M2型巨噬细胞通过Toll样受体增强卵巢癌细胞MMP-9的表达[J].基础医学与临床,2014,34(10):1315-1320.

[5]黄福海,潘丽英,徐楚燕,等.肿瘤相关巨噬细胞与卵巢癌组织之间的关系及预后的影响[J].中国医药科学,2016,6(5):166-168,175.

[6]汪洪,邓凯贤,郑玉华,等.卵巢癌组织与肿瘤相关巨噬细胞之间的关系及预后的影响[J].中国医药科学,2016,6(23):220-222.