恒河猴卵巢组织中年龄相关性差异基因的生物信息学分析

冀萌萌，谭雪梅，余凯伦，张秀丽，王宗立，陶宇昌，刘蔓蔓，高 湛，刘小转，余增丽

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)郑州市第二人民医院检验科 郑州 450006 3)郑州大学第五附属医院妇产科 郑州 450052 4)河南省人民医院科研与学科建设部 郑州 450003

目前，由于社会环境、生活压力以及“二胎”生育政策放开的影响，我国女性的生育年龄越来越晚[1]。但随着年龄的增长，女性的生育能力逐渐下降。因此探索卵巢衰老的病理生理过程和发生机制，并在此基础上找出延缓卵巢衰老的干预靶点，有重要意义。卵巢衰老主要表现为卵泡数量和质量的下降，年龄是最重要的影响因素[2-3]。人类原始卵泡池形成于胎儿期，在孕期20周时达到高峰，然后急剧减少，近青春期时，卵巢内原始卵泡仅剩40万个[4-5]。女性在50岁闭经时，卵巢中仅剩下大约1 000个原始卵泡[4,6]。目前，控制原始卵泡存活和丧失平衡的分子机制还不太明确。研究[7-10]表明，在卵泡发育过程中，大量mRNA和蛋白储存于卵母细胞内并被其利用，而卵母细胞转录活性的调节主宰着其对发育能力的最终获得。有研究[11-12]表明，年轻与老年女性之间决定卵母细胞生物功能的关键基因的转录水平存在差异，有可能与卵巢老化有关。

本研究通过分析基因表达谱芯片数据集GSE44533，鉴别不同年龄段的恒河猴卵巢样本中差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)，然后对DEGs进行GO富集、KEGG通路分析及蛋白质-蛋白质作用网络(protein-protein interaction, PPI)分析，探索卵巢组织中潜在的受年龄影响的生物标志物和信号通路。

1 材料与方法

1.1材料GSE44533数据集来源于美国国家生物信息中心的GSE数据库，该数据集包含了由GPL3535芯片平台采集的9个恒河猴卵巢样品的基因芯片表达谱数据，分为老、中、青3个年龄组，每组3个样品。其中，老年组恒河猴年龄18～19岁，已经丧失生育能力；中年组年龄7～8岁，为最佳生育期；青年组年龄3～4岁，具有正常规律的动情周期；均未繁殖过。按照中、青年恒河猴的动情周期记录，均于动情前期处死并采集卵巢。

1.2数据处理及DEGs的筛选首先，利用SAS 9.2 及RNA Express软件对GSE44533数据集进行预处理、背景矫正、数据标准化等。将探针与从Affymetrix官方网站(http://www.affymetrix.com)下载的注释文件进行匹配，得到包含官方基因符号的基因表达谱数据集；在Morpheus网络平台(https://sofeware.brodinstitute.org/morpheus/)，根据信噪比≥4或者≤-4，筛选出DEGs。

1.3DEGs的功能富集分析采用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在线对筛选出的DEGs进行功能富集分析，预设条件为ease score≤0.1 和 thresholds account≥2。功能富集分析主要包括GO功能分析和KEGG通路富集分析。

1.4DEGs的调控网络分析STRING(http://string-db.org/)是用于检索分子交互作用的搜索工具，旨在评估蛋白质-蛋白质相互作用的关系。新版本STRING10.5涵盖了来自于2 031个生物体的960万个蛋白质。本研究中，设置组合分数(combined score)>0.4过滤PPI数据，利用STRING检索DEGs中的交互基因，然后应用Cytoscape 3.5.1软件中的MCODE，按照预设条件(理发模式，节点评分截止值为0.2，K核心值为2)进行重塑，构建调控网络模块。

2 结果

2.1DEGs的筛选青年组与中年组卵巢基因表达谱比较，共有253个DEGs，其中123个基因表达上调，130个基因表达下调；中年组与老年组比较，共有68个DEGs，其中50个基因表达上调，18个基因表达下调；青年组与老年组比较，共有636个DEGs，其中460个基因表达上调，176个基因表达下调。

2.2DEGs的功能富集青年组与中年组、中年组与老年组、青年组与老年组DEGs的GO分析结果见表1～3，表内Count(%)为对应GO的DEGs数目(对应GO的DEGs数目/能够对应到GO数据库中同类型的DEGs数目×100%)；KEGG通路富集结果见表4，其中Count(%)为对应pathway富集基因数目(对应pathway富集基因数目/能够对应到pathway数据库中的DEGs数目×100%)。GO功能分析时，从细胞组分、分子功能和生物过程3个方面展开。结果表明，3组DEGs在全细胞和细胞外区域广泛分布，涉及氧化应激、DNA复制、修复和甲基化等方面。青年组与老年组的DEGs参与的生物过程主要有DNA结构与转录调控、DNA甲基化过程等；中年组与老年组的DEGs涉及的信号通路有卵母细胞减数分裂，涉及的基因为FBXO43、AURKA、PPP2R5E；而青年组与老年组的DEGs涉及丙酮酸代谢通路等。

表1 青年组与中年组的DEGs的GO分析

表2 中年组与老年组的DEGs的GO分析

表3 青年组与老年组的DEGs的GO分析

续表3

表4 3组DEGs的KEGG分析

2.3DEGs的调控网络PPI分析结果显示，仅青年组与老年组DEGs的模块M1(score=6，node=6，edges=15)和M2(score=4，node=4，edges=6)符合条件,其中，M1包含6个基因(SNRNP200、DDX46、SNRNP35、DAZ2、ELAVL2、RBM46，见图1、2)，M2包含4个基因(AURKa、EHMT2、AURKC、LOC715011)。

图1 青年组与老年组DEGs的PPI

图2 M1模块

3 讨论

随着年龄增长，卵巢逐渐老化，而卵巢衰老主要表现为卵泡数量和质量的逐渐下降，导致女性生育能力下降甚至不育。而原始卵泡被招募到生长卵泡池中进行后续的发育[4,13]，卵母细胞凋亡导致的原始卵泡丢失等[14]，均决定了卵巢老化的进程[4-5,15]。在这些过程中，不同年龄阶段的卵巢组织中基因表达谱可能存在差异，影响卵巢卵泡的数量及质量。本研究证实，青年组、中年组、老年组恒河猴卵巢组织中的基因表达谱存在差异。其中青年组与中年组之间有253个DEGs，中年组与老年组之间有68个DEGs，而青年组与老年组之间有636个DEGs。根据GO功能分析及KEGG通路富集分析结果，这些DEGs部分涉及卵母细胞减数分裂、丙酮酸代谢通路等。

在青年组与老年组DEGs的PPI分析中，模块M1包含6个基因,分别为SNRNP200、DDX46、SNRNP35、DAZ2、ELAVL2、RBM46，这6个基因存在细胞分子交互作用。其中ELAVL2最初被描述为神经元蛋白，但是有研究[16]表明在保守表达的卵母细胞中ELAVL2转录水平比体细胞更丰富，其与卵母细胞的发育到底有何联系，值得探索。RBM46(RNA结合基序蛋白46)转录后调控β-连环蛋白mRNA的降解，通过Wnt/β-联蛋白途径在胚胎干细胞分化调节中起重要作用[17]。DAZ2是精子发生相关蛋白，其在卵巢组织中出现异常表达，提示其可能对卵泡发育有关键调节作用，并且该调节与排卵后的精卵结合有关，当然，其在雌性生殖发育中的作用有待进一步研究。DDX46属于RNA解旋酶的DEAD盒系列，其涉及二级RNA结构的调节[18]，在复杂的器官发育中起重要作用。SNRNP35和SNRNP200均属于剪接因子。目前关于SNRNP200的研究较多关注的是其基因拷贝数突变与视网膜色素变性的关系[19-20]；关于SNRNP35的研究很少见，其可能是新发现的与卵巢发育有关的基因。

本研究虽然找出了不同年龄段恒河猴卵巢组织中部分基因表达的变化规律，但目前进行的数据分析工作还比较初步，今后还需要对筛选出来的关键基因进行各种实验验证，以探索其在卵巢卵泡发育过程中的作用，阐明卵巢衰老的病理生理过程和发生机制。

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