雷公藤红素对HGC-27细胞增殖、迁移及凋亡的影响

王 红，吴梦瑶，王秋宁，张 欣，李 红

1)锦州医科大学生化教研室 辽宁锦州 121000 2)锦州医科大学药理教研室 辽宁锦州 121000 3)锦州医科大学附属第一医院心胸外科 辽宁锦州 121000

胃癌是人类容易罹患的第五大恶性肿瘤。我国胃癌每年新发病例近50万，约占全球的50%，且发病率和病死率呈上升趋势的同时，发病人群趋向年轻化[1-2]。目前，胃癌的治疗以外科手术为主[3]，诊治水平虽不断提高，但部分患者术后效果欠佳，且一些胃癌晚期失去手术机会的患者缺乏有效的治疗手段，因此，寻找高效、低毒的胃癌治疗药物具有重要意义。雷公藤红素(celastrol)又称南蛇藤素，是一种具有多种生物活性的醌甲基三萜类天然产物，来源于中药雷公藤的根皮，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗肿瘤等活性，临床上广泛用于风湿疾病的治疗[4-5]。近年来有学者[6-9]将雷公藤红素用于抗肿瘤研究。本研究观察了不同浓度雷公藤红素对人胃癌HGC-27细胞增殖、迁移及凋亡的影响，探究其抗肿瘤作用机制，为胃癌的药物治疗提供新的依据与解决方案。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器RPMI 1640培养基购自美国康宁公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，DPBS购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自德国PAN公司，四甲基偶氮唑盐(MTT)购自纳川公司，雷公藤红素购自鸿汲康润生物医药公司， 抗Bcl-2、Bax、Caspase3抗体购自万类生物公司，抗ERK、磷酸化-ERK (p-ERK)、P38与磷酸化-P38(p-P38)抗体购自Abcam公司，内参β-actin、GAPDH购自CST公司，AnnexinV-FITC/PI检测试剂盒购自万类生物公司。酶标仪(美国Thermo公司)，蛋白电泳仪与凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2细胞培养人胃癌细胞系HGC-27(未分化)由锦州医科大学药理教研室王秋宁老师赠予，用完全培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青链霉素和100 mg/L链霉素)于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。胰蛋白酶消化，2～3 d传代一次，待细胞处于对数生长期时用于实验。

1.3雷公藤红素作用后HGC-27增殖比率的测定

将对数生长期的细胞分别接种于96孔培养板中，7×103个/孔，待细胞贴壁后，分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 μmol/L的雷公藤红素培养0、24、48、72 h。在对应的时间点采用MTT法测定细胞增殖比率。加入MTT(5 g/L)20 μL/孔，避光培养4 h后，吸取培养孔内的液体，加入200 μL DMSO，酶标仪振荡10 min,在490 nm波长下检测吸光度。每个浓度每个时间点设置3个复孔。增殖比率=实验组吸光度/相应0 h组吸光度。

1.4雷公藤红素作用后HGC-27迁移率的测定采用划痕实验。取对数生长期的HGC-27细胞经胰蛋白酶消化，以3×106个/孔接种在6孔培养板中，待细胞铺满，用20 μL移液器吸头进行划痕，PBS洗去划下的细胞，加入含不同浓度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤红素的培养基，培养48 h后，镜下拍照，通过测量划痕宽度，计算迁移率。迁移率=(0 h划痕宽度-其他时间点划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。每组3个复孔。

1.5雷公藤红素作用后HGC-27凋亡率的检测取对数生长期的HGC-27细胞，接种在6孔培养板中，待细胞贴壁后，加入含不同浓度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤红素的培养基处理48 h，胰蛋白酶消化，收集细胞，加500 μL Binding buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混匀后，加10 μL PI混匀，同时设置两个单阳管，室温避光5～15 min后上流式细胞仪检测。每组3个复孔。

1.6雷公藤红素作用后HGC-27中核凋亡小体的检测采用Hoechst32258染色法。取对数生长期的HGC-27细胞，接种到细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入含不同浓度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤红素的培养基处理48 h，吸去培养基，加入Hoechst32258染色液覆盖细胞，继续培养30 min，用PBS洗2次，进行荧光检测。每组3个复孔。

1.7雷公藤红素作用后HGC-27中相关蛋白的检测采用Western blot法检测Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、P38、ERK及p-P38、p-ERK的表达。收集不同浓度(0.0、0.5、1.0、1.5 μmol/L)雷公藤红素刺激48 h的细胞，胰蛋白酶消化后，用预冷的PBS洗3次，加细胞裂解液，冰上振荡30 min使细胞裂解完全，于4 ℃下14 000g离心5 min，取上清，BCA法测蛋白浓度。制作100 g/L SDS-PAGE胶，按照30 μg上样量电泳分离蛋白，转膜，BSA室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗5 min×3次，二抗室温孵育2 h后，用TBST洗5 min×3次，ECL化学发光显色，对条带进行显影拍照，以目的条带与内参条带的比值表示目的蛋白的相对表达水平。每组3个复孔。

1.8统计学处理应用SPSS 13.0进行统计学分析。HGC-27细胞增殖比率的比较采用7×3析因设计的方差分析，HGC-27迁移率、早期凋亡率、相关蛋白相对表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度雷公藤红素作用后HGC-27增殖比率的比较MTT法检测结果(表1)表明，雷公藤红素对HGC-27增殖有抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。

2.2 4组HGC-27细胞迁移率的比较划痕实验结果(表2、图1)显示，1.0、1.5 μmol/L雷公藤红素组细胞迁移率明显下降(P<0.05)。

2.3 4组HGC-27细胞凋亡率的比较流式细胞仪检测结果(表2)显示，雷公藤红素可促进HGC-27细胞的早期凋亡。

表1 各组HGC-27增殖比率的比较(n=3)

F时间=729.864，F浓度=1 295.496，F交互=208.758，P<0.001

表2 4组HGC-27细胞迁移率和早期凋亡率的比较

*:与0.0 μmol/L组比较，P<0.05；#：与0.5 μmol/L组比较，P<0.05

图1 划痕实验(×100)

2.4 4组HGC-27细胞核凋亡小体检测结果Hoechst32258染色结果(图2)显示：与0.0 μmol/L组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L组HGC-27细胞核染色增强，荧光明亮，细胞核出现边集化，出现明显核固缩，细胞呈团块状，表现出了凋亡特征；并且随着作用浓度的升高，表现更加明显。

图2 4组细胞核凋亡小体的形成(Hoechst32258染色，×200)

2.5 4组HGC-27细胞中相关蛋白表达的比较Western blot检测结果(图3和表3、4)表明，雷公藤红素可促进HGC-27细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、p-P38的表达，降低Bcl-2和p-ERK的表达。

1：0.0 μmol/L组；2：0.5 μmol/L组；3：1.0 μmol/L组；4：1.5 μmol/L组图3 4组HGC-27细胞中相关蛋白的表达

表3 4组HCG-27细胞中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达的比较

*：与0.0 μmol/L组比较，P<0.05；#：与0.5 μmol/L组比较，P<0.05；△：与1.0 μmol/L组比较，P<0.05

表4 4组HCG-27细胞侵袭相关蛋白表达的比较

*：与0.0 μmol/L组比较，P<0.05；#：与0.5 μmol/L组比较，P<0.05；△：与1.0 μmol/L组比较，P<0.05

3 讨论

蛋白质的合成和降解在维持细胞状态的稳定中发挥重要作用。细胞内大部分的蛋白质都是由蛋白酶体降解的，蛋白酶体的靶蛋白在肿瘤的形成中起到关键作用[10]，如周期蛋白、肿瘤抑制蛋白、促肿瘤生长蛋白等。雷公藤红素是一种蛋白酶体抑制剂，其可以通过抑制热休克蛋白90(Hsp90)和蛋白酶体[11]，也可以通过抑制NF-κB信号通路[12]、PI3K/AKT/mTOR通路[12-13]和MAPK通路[[11]，发挥抗肿瘤作用。有文献[6-9]报道其可以抑制前列腺癌、鼻咽癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长。Yu等[14]的课题组发现雷公藤红素能够抑制骨肉瘤细胞的迁移。

本研究初步探索了雷公藤红素对胃癌HGC-27细胞的抑制作用及其可能的作用机制。研究结果显示，雷公藤红素可抑制HGC-27细胞的增殖，并且该抑制作用随作用浓度的升高和作用时间的延长而逐渐增强；雷公藤红素可诱导HGC-27细胞凋亡，降低HGC-27细胞的迁移能力，与文献[13-15]报道相符。进一步的实验发现，雷公藤红素作用后HGC-27细胞中凋亡相关蛋白Bax、Cleaved Caspase-3的表达明显升高，而Bcl-2则表达降低；侵袭相关蛋白p-P38表达升高，而p-ERK则表达降低。Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡的调节相关，Bcl-2/Bax比例失调可促使细胞凋亡的发生[7，16]，两者通过蛋白酶体途径降解。Caspase-3在介导细胞凋亡中起重要作用，并且是PARP分解的主要因素，Cleaved-PARP不能完成DNA修复和调节，可激活细胞凋亡机制中的细胞内信号[17-18]。Cleaved Caspase-3是凋亡效应产物。雷公藤红素作为一种蛋白酶体抑制剂，可能通过抑制蛋白酶体的降解而促进Bax的表达，从而使得Bcl-2/Bax比例失调，通过细胞内凋亡机制诱导了HGC-27细胞的凋亡。ERK、P38是MAPK通路中的重要组成成分。本实验中p-ERK、p-P38表达量的变化提示MAPK信号通路参与了雷公藤红素诱导的胃癌HGC-27细胞迁移能力的降低。

总之，本研究结果表明，雷公藤红素可能通过MAPK信号通路抑制了胃癌细胞的增殖、迁移并诱导凋亡，这为其用于胃癌的治疗提供了实验依据，而雷公藤红素具体的抗癌机制仍需要进一步的探索。

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