山葡萄皮花青素超声波辅助提取及抗氧化活性研究

（黑龙江民族职业学院，黑龙江哈尔滨150066）

山葡萄为葡萄科葡萄属植物，主要种植在我国的东北地区，其种植资源丰富、抗寒性强、葡萄皮花青素含量高等特点[1]。当前市面上以葡萄为原料的产品主要有葡萄酒、葡萄果汁，因其具有独到的风味和滋补养身等功效备受人们的喜爱。葡萄皮作为生产葡萄酒和葡萄果汁的副产物（占整个葡萄的10%）被大量遗弃，不仅造成严重的资源浪费，而且还污染环境。目前，如何将副产物变废为宝以及如何提高副产物利用率已经成为人们关注的热点问题。

葡萄皮中含有大量的花青素，花青素属于类黄酮类的化合物，是一种安全绿色的天然色素。研究表明：花青素具有抗氧化[2]、抗菌消炎[3]、保护心脑血管[4]以及缓解视疲劳[5]等功效。如何高效地从葡萄皮中提取花青素是科研工作者备受关注的问题。目前对花青素的提取主要采用热浸提法[6]、微波辅助提取法[7]、高压脉冲电场法[8]、超声波提取法[9]。其中超声波提取是一种新型的植物活性成分提取技术，它是利用超声波的空化效应、热效应、机械效应加速细胞壁破裂，减小花青素扩散阻力，使细胞内的花青素更容易从细胞中扩散到周围溶剂，从而有效提高了花青素得率[10]。李大婧等[11]采用超声波技术从万寿菊中提取叶黄素，研究发现叶黄素的得率高达97%。李山等[12]采用超声波辅助提取花生壳中的黄色素结果超声波提取能显著提高黄色素的得率。黄静等[13]对比不同提取方式对万年蒿总黄酮得率的影响，研究发现超声波辅助提取得到的总黄酮明显高于其它提取方式。但超声波提取山葡萄皮花青素的研究未见报道，为了提高山葡萄皮的利用率，本文采用超声波辅助提取山葡萄皮花青素，通过单因素试验探究超声波功率、超声温度、乙醇浓度和料液比对花青素得率的影响，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法中的Box-Behnken试验设计，优化出超声波辅助提取山葡萄皮花青素的工艺参数，为以后更深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

山葡萄：哈尔市香坊农产提供；香草醛、浓盐酸、甲醇、无水乙醇、水杨酸：均为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1'-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国 Sigma公司；抗坏血酸、过硫酸钾：美国Fisher公司。

1.2 设备与仪器

AB204-S型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ600DB超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV-1700分光光度计：日本岛津公司；DRYER真空冷冻干燥器：德国西门子公司；LG10-2.4A离心机：北京京立离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山葡萄皮的预处理

挑选成熟度均一的山葡萄，经除杂、清洗、去除果肉，将葡萄皮置于真空冷冻干燥机冻干，然后用粉碎机粉碎，过40目筛，制成葡萄皮粉末，避光密封保存在4℃冰箱中备用。

1.3.2 山葡萄皮花青素提取

准确称取2.00 g山葡萄皮粉置于萃取容器中，加入试验预先确定体积和浓度的乙醇作为萃取剂来构建萃取体系。将萃取体系置于超声波中，设定超声波功率为400 W～800 W间隔为100 W，超声温度为30℃～70℃，超声30 min。超声结束后，将提取液4 000 r/min离心15 min，将上清液和渣液分离，将渣液用预先设定浓度的乙醇洗涤直到渣液无色，合并渣液和上清液得最终花青素提取液，采用紫外分光光度法，在500 nm处测定提取液的OD值，计算出花青素得率。

1.3.3 山葡萄皮花青素得率的计算

准确称取0.02 g花青素标准品，用60%酸化乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，然后分别准确取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL的标准液，然后用 60%酸化乙醇定容至10 mL，分别从10 mL中各取1 mL置于10 mL具塞的比色管中（另取60%酸化乙醇液为对照液），分别加入5 mL显色剂，摇匀，避光，在30℃恒温水浴锅中保持30 min，保温比色，在500 nm波长处，测定吸光值，绘制标准曲线，标准曲线方程为A=0.831 6C-0.035 1，R2=0.999 8。

花青素得率的计算公式如式（1）所示：

式中：C为花青素浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；n为稀释倍数；W试样质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

在预试验的基础上，选择乙醇作为提取溶剂，超声波作为提取方法。以2.00山葡萄粉为提取对象，对超声波功率、超声温度、乙醇浓度、料液比4个因素进行单因素试验，讨论它们对花青素萃得率的影响。其中超声波功率设 400、500、600、700、800 W 5 个水平；超声温度设 30、40、50、60、70 ℃ 5个水平；乙醇浓度设40%、50%、60%、70%、80%5个水平；料液比设1 ∶10、1 ∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）5 个水平。所得试验数据均为3次重复试验所得的平均值。

1.3.5 响应曲面法试验设计

在单因素试验结果的基础上，以超声波功率、超声温度、乙醇浓度和料液比作为试验因素，以花青素得率为目标值。根据Box-Behnken组合试验设计原理，优化出超声波辅助提取山葡萄皮花青素的工艺。因素水平编码表如表1所示。

表1 试验设计因素水平及编码表Table 1 Factors，levels and coding table of test design

采用响应面分析法得到的二次回归模型如下：

式中：b0为截距回归系数；bi为线性回归系数；bii为交互项的回归系数；bij为交互项的回归系数；Xi，Xj为自变量。

1.4 山葡萄皮花青素抗氧化能力的测定

1.4.1 DPPH自由基清除率的测定

参照封燕等[14]的方法并略作改动。将最优工艺得到山葡萄皮提取液配制成质量浓度为0.1 mg/mL～0.5 mg/mL的样品液，每个样品液取2 mL，然后分别加入2.8 mLDPPH溶液并将其充分混合，避光室温下放置30 min，在517 nm处分别测定其吸光值。以无水乙醇溶液代替样品溶液作对照，按照式（3）计算DPPH自由基的清除率。抗坏血酸对DPPH自由基清除率的测定同上述操作。

式中：A样品为山葡萄皮提取液的吸光度；A对照为抗坏血酸的吸光度。

1.4.2 ·OH清除率的测定

参照吕春茂等[15]的方法并稍作修改。将最优工艺得到山葡萄皮提取液配制成质量浓度为0.1 mg/mL～0.5 mg/mL的样品液，分别取样品液1 mL置于5个10 mL具塞比色管中，然后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2、1 mL 10 mmol/L FeSO4、1 mL 10 mmol/L 水杨酸-乙醇，在37℃恒温水浴锅中反应30 min，以蒸馏水代替样品溶液作对照，在510 nm处测定其吸光值，按照式（4）计算·OH的清除率。抗坏血酸对·OH清除率的测定同上述操作。

式中：ΔA为加入花色苷与未加花色苷吸光值之差；A对照为抗坏血酸的吸光度。

1.5 数据处理

对每一组试验数据进行方差分析（ANOVA）；采用SAS8.0（SAS Institute Inc.，NC，USA）软件分析结果的显著差异；SigmaPlot12.5 （SPSS，Inc.，Chicago，US）进行单因素作图；采用Design Expert ver8.0（SAT-EASE，Inc.，Last September，UK）软件设计组合试验。

2 结果与讨论

2.1 超声波提取条件对山葡萄皮花青素得率影响规律

为了确定组合试验各因素取值范围和研究超声波功率、超声时间、乙醇浓度、料液比4个因素对山葡萄皮花青素得率的影响，结果如图1所示。

图1 不同因素对花青素得率的影响Fig.4 Effects of different factors on the yield of anthocyanins

由图1（A）可知，随超声波功率的增加，花青素得率呈现先显著增加后显著降低的趋势（p<0.05）。当超声波功率在400 W～600 W时，随着超声波功率的增加花青素得率显著增加（p<0.05），当超声波功率在600 W时，花青素的得率最大（80.21%）。这是由于随超声波功率的增加，超声波所产生的空化效应和机械震动效应增强，在萃取液中产生强烈的剪切力，引起山葡萄皮细胞壁破裂，使细胞内花青素传质阻力显著降低，有效增加溶剂对花青素的传质作用，进而促进花青素从山葡萄皮细胞中快速释放出来[16]。因此，花青素得率随超声波功率的增而显著提高。但当超声波功率在600 W～800 W时，随着超声波功率的增加花青素得率显著降低（p<0.05）。其原因是超声波功率过高，超声波所产生的高强度空化作用一方面破坏花青素结构，同时也增加了超声波装置的负担[17]。另一方面引起非活性成分杂质的溶解，减小了花青素溶解。因此，花青素得率显著降低。综合考虑，选择超声波功率为500、600、700 W作为后续组合试验的因素水平。

由图1（B）可知，花青素得率随超声温度的增加呈现先显著增加后显著降低的趋势（p<0.05）。当超声温度在30℃～50℃时，随着超声温度的增加花青素得率显著增加（p<0.05）。当超声温度在50℃时，花青素的得率最大（80.45%）。这是由于随超声温度的增加，溶剂渗透作用增强，粘度降低，花青素溶解度增加，传质系数增加，阻力降低，更有利于花青素从山葡萄皮中溶出，从而使花青素得率显著增加。但当超声温度在50℃～70℃时，花青素得率随超声温度的增加而显著降低（p<0.05）。原因是花青素属于热敏性成分，高温一方面会加大超声波的空化效应和热效应。另一方面高温破坏花青素与糖分子形成的糖苷键[18]，引起花青素呈指数形式降解[19]，结果使花青素得率显著降低。综合考虑，选择超声温度为40、50、60℃作为后续组合试验的因素水平。

由图1（C）可知，花青素得率随乙醇浓度的增加呈现先显著增加后降低的趋势（p<0.05）。当乙醇浓度在40%～60%时，随着乙醇浓度的增加花青素得率显著增加（p<0.05）。原因是由于随乙醇浓度的增加，花青素在溶剂中的溶解度增加，有利于传质。当乙醇浓度在60%时，此时溶剂的极性和花青素极性相似，根据相似相容原理，花青素溶解度达到最大，得率最高[20]。当乙醇浓度在60%～80%时，随乙醇浓度的增加，花青素得率显著降低（p<0.05）。一方面是由于高浓度乙醇易溶解醇溶性、色素和亲脂性强的杂质，其成分与花青素竞争乙醇-水分子，使得花青素溶出量降低，进而导致花青素萃取率降低[21]。另一方面，高浓度的乙醇破坏花青素-蛋白质和花青素-纤维素之前的氢键和疏水键[22]，破坏花青素结构，因此花青素萃得率降低。综合考虑，选择乙醇浓度为50%、60%、70%作为后续组合试验的因素水平。

由图1（D）可知，花青素得率随料液比的增加呈现先显著增加后降低的趋势（p<0.05）。当料液比在1 ∶10（g/mL）～1 ∶30（g/mL）时，随料液比的增加花青素得率显著增加（p<0.05）。原因是由于随料液比的增加，细胞内外浓度差增大，传质驱动力增加，花青素易于从细胞内扩散出来，从而使花青素得率增加[23]。但是当料液比在 1 ∶30（g/mL）～1 ∶50（g/mL）时，花青素得率随料液比的增加呈缓慢降低的趋势。其原因是溶剂过大，吸收超声波能量增加，而空化泡对能量吸收相应降低，细胞壁破裂不明显，传质阻力大，不利于花青素从细胞中扩散出来。另外溶剂过大，会对后续提取物的浓度带来很大的工作量。因此，综合考虑，选择料液比为 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）作为后续组合试验的因素水平。

2.2 山葡萄皮花青素提取工艺优化结果与分析

2.2.1 模型建立与显著性检验

确定响应面法优化超声波辅助提取山葡萄皮花青素最佳工艺条件，所得的试验方案和结果见表2。

以花青素得率Y为响应值，对试验所得的数据进行多元回归拟合分析，得到山葡萄皮花青素得率对A（超声波功率）、B（超声温度）、C（乙醇浓度）和D（料液比）的回归方程：

表2 响应曲面法试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology

续表2 响应曲面法试验设计及结果Conyinue table 2 Experimental design and results of response surface methodology

对回归方程系数进行显著性检验，结果如表3所示。

由表3可知，方程一次项中B、C为极显著因素，A为显著因素，D为不显著，因素对山葡萄皮花青素得率影响的主次顺序为 B＞C＞A＞D；方程二次项中 A2、B2、C2、D2均为极显著因素；各交互项AB、AC、AD为极显著因素，其余均不显著。结果表明试验因素对响应值不是简单的线性关系，模型中（p＜0.001），多元回归关系显著，相关系数R2=0.908 5、模型的变异系数C.V.=0.562 9，失拟项为 0.427 2（p＞0.05），失拟不显著，说明方程拟合充分，回归方程高度显著，可以较好地描述各因素与响应值的真实关系，利用该回归方程可以确定优化超声波辅助提取山葡萄皮的最佳工艺条件。

表3 超声波辅助提取山葡萄皮花青素回归模型系数的显著性检验报告Table 3 Ultrasonic assisted extraction of mountain grape skins green significant test report in regression coefficient

续表3 超声波辅助提取山葡萄皮花青素回归模型系数的显著性检验报告Continue table 3 Ultrasonic assisted extraction of mountain grape skins green significant test report in regression coefficient

2.2.2 山葡萄皮花青素得率的响应面分析

依据响应曲面得到的回归方程，建立花青素得率与试验因素的三维空间的曲面图，确定最大花青素得率条件。各试验因素对花青素得率的交互影响见图2。

如图2所示，各图表示超声波功率、超声温度、乙醇浓度和料液比任意两个变量取零水平时，其余两个变量对山葡萄皮花青素得率的影响。这些图可以直观发映出各因素对花青素得率的影响，确定最佳提取花青素的工艺参数范围区间以及各参数之间的相互作用。

图2 各试验因素对花青素得率的交互影响Fig.2 Interactive effects of different test factors on yield of anthocyanin

根据表3中方差分析的结果可知，超声波功率和超声温度、超声波功率和乙醇浓度以及超声波功率和料液比的交互作用对花青素得率均呈现极显著影响（p＜0.001），其余因素的交互作用对花青素得率影响均不显著（p＞0.05）。综合图1（A～F）可知，当超声波功率在550 W～650 W，超声温度在4 5℃～55℃，乙醇浓度55%～65%和料液比在 1∶25（g/mL）～1∶35（g/mL）时，山葡萄皮花青素有较高的得率。在一定范围内适当提高超声波功率，利用超声波的空化效应，有利于花青素溶出，但当超声波功率高于650 W时，超声波强烈的空化作用破坏花青素结构，不利于花青素提取。在一定范围内适当提高超声温度，能提高传质系数，降低溶剂粘度，有利于花青素溶出，但当超声温度高于55℃时，高温使花青素大量降解，显著降低花青素得率。当乙醇浓度在55%～65%时，适当增加乙醇浓度，使提取液溶解花青素浓度增强，在乙醇浓度为60%时，花青素溶解度达到最大，此时花青素萃取率也达到最大值。当乙醇浓度高于65%，溶解花青素能力降低，引起花青素得率降低。当料液比低于1∶25（g/mL）时，固液界面的浓度梯度较低，不利于花青素扩散和溶解，使得花青素得率较低。当料液比在高于1∶35（g/mL）时，过多溶剂不利于后期提取液浓缩，给后续试验增加难度，不利于花青素提取。

2.2.3 验证试验

通过Design Expert软件对式（3）的回归方程分析，得到最佳提取条件：超声波功率580.78 W、超声温度 48.36℃、乙醇浓度 57.65%、料液比 1∶28.72（g/mL），花青素萃取率的理论值86.33%，为了验证该方法的可靠性，考虑实际情况，将最佳工艺参数修正为：超声波功率580 W、超声温度48℃、乙醇浓度58%、料液比1∶29（g/mL），在此条件下进行花青素得率的验证试验，试验重复3次，平均值为83.17%，理论值和试验值的相对误差为3.66%。说明模型可以较好地模拟和预测山葡萄皮花青素得率，从而也证明了采用响应面法优化花青素提取条件参数的可行性。

2.3 山葡萄皮花青素抗氧化活性

在超声波功率580 W、超声温度48℃、乙醇浓度58%、料液比1∶29（g/mL）下获得的山葡萄皮花青素进行抗氧化活性测定并以抗坏血酸作对照，其结果如图3所示。

图3 超声波辅助提取后花青素抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of anthocyanin after ultrasonic assisted extraction

由图3（A）可知，随花青素提取液浓度的增加，对DPPH自由基清除能力显著增加（p＜0.05），且高于抗坏血酸VC。其原因可能是由于花青素提取液浓度越大，单位体积内花青素B环酚羟基数目越大，B环中的酚羟基作为主要的还原部位，在氧化过程中，B环酚羟基作为供氢体可以与氧化过程中产生的DPPH自由基发生反应，自身形成的自由基可以通过分子内氢键、半醌式自由基等形式得以稳定，从而中断自由基链的反应[24]。因此，随花青素提取液浓度的增加DPPH自由基的清除率显著增加。

由图3（B）可知，随花青素提取液浓度的增加，对·OH清除能力显著增加（p＜0.05），且高于抗坏血酸VC。这是由于花青素提取液浓度越大，更利于脱氢形成供氢体，当机体在发生氧化还原产生过量的羟基自由基时，花青素作为供氢体更易于过量的羟基自由基结合，从而保护机体免受·OH的损坏[25]。

3 结论

1）通过响应曲面法建立了以山葡萄花青素得率为响应值，以超声波功率、超声温度、乙醇浓度和料液比为试验因素的数学模型Y=80.64-1.65A+2.42B+2.33C-1.00D+5.47AB+3.87AC+5.62AD+0.49BC-0.48BD+1.14CD-4.16A2-3.10B2-4.23C2-4.38D2，R2=0.908 5，说明可以利用该回归方程确定超声波辅助提取山葡萄皮花青素的最佳工艺条件。因素对花青素得率影响的主次顺序为超声温度＞乙醇浓度＞超声波功率＞料液比。

2）经响应曲面法优化超声波辅助提取山葡萄皮花青素最佳的工艺参数为：超声波功率580 W、超声温度48℃、乙醇浓度58%、料液比1∶29（g/mL）。在此条件下，理论花青素得率为86.33%，试验条件下花青素得率的平均值为83.17%，理论值和试验值相对误差3.66%。

3）在最优工艺条件下，对山葡萄皮花青素进行抗氧化活性试验，研究发现随花青素浓度的增加，对DPPH自由基和·OH的清除率显著增加且高于抗坏血酸VC。

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