NH3应激肉鸡呼吸道两株致病菌的分离和鉴定

（商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘476000）

随着消费者膳食结构的改变和安全意识的增强，动物源性食品安全已经成为全球共同关注的热点问题。近年来，我国肉鸡养殖业发展态势迅猛，已然成为世界第二大肉鸡生产国[1]，畜舍空气质量是保证肉鸡养殖成功和保障鸡肉品质的关键[2]。然而，由于高密度、集约化的养殖模式，养殖环境特别是鸡舍内有害气体对肉鸡生产所带来的危害亦愈发严重，其中，NH3被认为是肉鸡舍内最有害的气体[3-5]，直接刺激、损伤畜禽呼吸道，形成呼吸道炎症，诱发呼吸系统疾病，并引起其他并发症。而且，据研究报道，长时间低浓度的NH3刺激，会有助于病原微生物在动物机体内的定植[6]，损伤肉鸡呼吸道上皮细胞，造成呼吸困难，降低免疫力，引发结膜炎和腹水症，大大提高肉鸡的死亡率和发病率，给肉鸡养殖业带来巨大的经济损失[3，7-8]。并且鸡舍高浓度氨气可降低鸡的抗氧化能力，影响鸡肉品质，且随着氨气浓度的升高而逐渐增强，具有时间累加效应[9]。

研究证明，养殖场的NH3通过刺激嗅觉神经和三叉神经，易引发慢性支气管炎、高早产死亡率、哮喘疾病等，影响人畜的呼吸功能，危害人畜健康[10-11]，也是养殖场周边环境空气质量PM2.5形成的主要原因之一[9，12]。呼吸道是一个开放性器官，是NH3进入动物机体的门户，而呼吸道正常菌群是抵御外来异物的第一道防线，对于动物机体的免疫功能起着至关重要的作用。但是，迄今为止，对于NH3应激条件下，由呼吸道微生态失衡而造成的鸡源肉制品安全的相关研究还鲜见报道。

因此，本研究将于NH3应激肉鸡呼吸道中采集喉拭子，对呼吸道微生物进行分离纯化，探索畜舍空气环境质量对肉鸡呼吸道微生态的影响，揭示NH3应激条件下鸡源肉食品的潜在安全风险及其实质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

将1日龄健康罗斯308肉鸡公雏和母雏各10羽，置于密闭的环境控制仓，内置监控摄像头可随时观察实验动物的行为变化，并安装固定式氨气气体检测仪FIX800-NH3-A（深圳市万安迪科技有限公司）以实时监测舍内氨气浓度，舍内氨气浓度为60 mg/m3。试验为期42 d，自由采食。

1.1.2 培养基

营养琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、MH肉汤培养基：青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 试剂与仪器

λDNA/HindⅢ：生工生物工程（上海）股份有限公司；2000 DNAMarker：宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq MasterMix：上海莱枫科技有限公司；脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；柠檬酸钠、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市纵横工贸有限公司化工试剂公司；无水乙醇（分析纯）：天津基准化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氯化钠（NaCl，分析纯）：天津市德恩化学试剂有限公司；三氯甲烷（trichloromethame，分析纯）；异戊醇（分析纯）：天津大茂化学试剂厂；三（羟甲基）氨基甲烷 [tris-（hydroymethyl）-aminomethane，分析纯]：天津市科密欧化学试剂有限公司。

Telstar BIO IIA超净工作台：西班牙Telstar；Centrifuge 5424小型高速离心机、Centrifuge 5810R台式高速冷冻离心机：德国Eppendorf；JY-SPCT凝胶电泳槽、JY600+双恒定时电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司；MLS-3750立式高压灭菌器、MDF-4186S超低温冰箱：日本SANYO；Gel Doc XR+凝胶成像仪：美国Bio-Rad；Piko Real实时荧光定量PCR仪：美国Thermo Fisher Scientific；Direct-Q3超纯水一体化系统：美国Millipore；DNP-9082电热恒温培养箱、ZHP-100智能恒温震荡培养箱：上海三发科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集与处理

用无菌棉拭子于咽后壁取样，于无菌操作台上将取样后的棉拭子放入装有5 mL无菌生理盐水的10 mL离心管中，折断手柄；震荡离心管，用移液器吸取100 μL液体涂布胰酪大豆胨液体培养基平板；将接过菌的平板置于恒温培养箱中，37℃培养24 h。

1.2.2 菌株分离与纯化

利用平板划线接种法进行微生物分离。挑取平板上不同形态的菌落并在营养琼脂培养基五点划线后，将平板置于恒温培养箱中，37℃培养24 h。重复上述操作直至平板上长出单个菌落。挑取平板上单菌落于装有MH肉汤培养基的试管内，分别标记TSB87001、TSB87002和TSB87003。

液体培养24 h后，用冻存管和离心管从每管菌液中各取约1.5 mL，1 000 g高速离心5 min，于超净工作台上倒掉上清，冻存管内加入约1.5 mL的脱脂牛奶充分混匀后，放入-80℃冰箱内进行菌种保存。离心管内的菌体冻存在-20℃，以备提取DNA。

1.3 微生物的分子鉴定

1.3.1 微生物DNA的提取

取出冻存在-20℃的菌体，向离心管内加入500 μL 0.15 mol/L NaCl-柠檬酸钠缓冲液重悬菌体，移至无菌研磨器中，仔细研磨10 min；1 mL NaCl-柠檬酸钠缓冲液冲洗研磨杵上的菌体2次至研磨器中，将研磨器中的液体移至离心管中，用NaCl-柠檬酸钠缓冲液冲洗研磨器2次每次1 mL，冲洗液移至离心管内，6 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；向沉淀中加入5 mL NaCl-柠檬酸钠缓冲液，重悬沉淀；6 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；再用5 mL NaCl-柠檬酸钠缓冲液重悬沉淀，6 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；用5 mL 0.15 mol/L NaCl-EDTA和1 mL 0.05 g/mL SDS重悬沉淀，并振荡10 min；取4.5 mL至另一离心管中，加 4.5 mL 氯仿异戊醇（24∶1）振荡 10 min，3 600 r/min，4℃离心10 min；取最上层水相加入等体积氯仿异戊醇，3 600 r/min，4℃离心10 min；取上清加入95%乙醇边加边摇动至DNA析出或放入冰箱冷冻10 min～30 min，12 000 r/min，4℃离心 10 min；用 75%乙醇洗涤2次，置超净工作台中晾干；用50 μL 1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀，并转移至1.5 mL离心管中，分装4 μL用于电泳检测，置-20℃冰箱保存备用。

1.3.2 引物的选择及PCR反应

采用细菌 16S rRNA 基因通用引物：（27F）5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和（533R）5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’进行PCR扩增。引物由华大基因科技股份有限公司（北京）合成。

PCR 总体系为 25 μL，其中 12.5 μL 2× Taq Master Mix，基因组DNA为1 μL，正向和反向引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。于 94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。

1.3.3 PCR产物的凝胶电泳监测

扩增产物采用1.5%的凝胶电泳检测，电泳缓冲液1×TAE[三（羟甲基）氨基甲烷乙酸盐乙二胺四乙酸缓冲液，tris acetate-EDTA buffer]，1 μL 上样缓冲液与2 μL基因组DNA混合均匀点样，同时点5 μL DL2 000 Marker作为参照，100 V电压下电泳20 min，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察结果并照相。

1.3.4 菌种鉴定

将含有目的条带的PCR产物送华大基因科技股份有限公司（北京）测序。序列利用http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行比对，确定微生物种属。如果两条序列的相似性小于97%，就认为是不同的序列类型[13-17]。

2 结果与分析

2.1 PCR产物的电泳结果分析

将分离得到的3株菌提取基因组DNA后，用细菌16S rRNA基因通用引物27F/533R进行PCR扩增，扩增产物电泳结果如图1所示，在约500 bp处，样品TSB87001、TSB87002有目的条带而样品TSB87003没有目的条带，说明此样品DNA中没有所要的细菌DNA，因此，此样品不再做进一步研究。

2.2 菌种的分子鉴定

图1 分离菌株的16S rRNA基因的PCR电泳结果Fig.1 The PCR electrophoresis results of the 16S rRNA gene of the isolated strains

选择含有目的条带的样品TSB87001、TSB87002的PCR产物送去测序。测序结果进行Blastn序列比对，结果表明：菌株TSB87001和TSB87002分别与Cronobacter sakazakii（GenBank：HQ880345.1）和Vibrio cholerae（GenBank：JN873349.1）的相似性达到 97%，初步鉴定为阪崎肠杆菌和霍乱弧菌。

3 讨论

畜舍空气质量是保证畜禽养殖成功和畜产品质量安全的重要保证[2]。NH3是畜舍内产生量最多、危害最大的有害气体之一[18-19]，通过鼻腔进入呼吸道，破坏心脏和气管组织，造成继发感染和破坏肌肉细胞膜的完整性，造成肉品质下降[21-22]，同时给养殖工人和周边环境带来严重威胁。长期生活于NH3环境中的畜禽对病原微生物的易感性增加，可引起呼吸道损伤[19]，诱发呼吸系统疾病及其他并发症，给养殖场带来巨大的经济损失。但是，由畜舍空气环境质量造成鸡肉食品安全的具体研究还鲜见报道。

本研究将罗斯308肉鸡饲养于一定浓度的NH3环境中，经过稀释平板法和借助分子生物学技术，从NH3应激肉鸡呼吸道中分离到了两株致病菌阪崎肠杆菌和霍乱弧菌，研究结果为畜舍空气质量直接影响畜产品品质及安全提供了直接的试验证据。阪崎肠杆菌是一种有周生鞭毛、能运动、兼性厌氧的、人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在一定条件下可引起人和动物致病[22-25]，该菌虽然从不同环境和食物样品中都曾被检测到，如奶粉、水、面包、香肠、蔬菜等[23]，但其在自然界的传播渠道和污染来源尚不清楚。阪崎肠杆菌正是由于能够形成菌毛结构，除可帮助细菌浸染外，还使得阪崎肠杆菌非常容易黏附在各种表面。霍乱弧菌是引起鸡霍乱的致病菌，引发鸡出血性败血症，是严重危害养鸡业的一种急性败血性传染病，该病的死亡率很高，最急性病例几乎看不到前驱症状而突然死亡。

畜舍空气环境质量不佳，特别是NH3浓度过高，除了会影响肉鸡生长性能和存活率之外，还会损伤气管的免疫功能[19]，如鸡舍中的NH3浓度达到50 mg/L时，引起呼吸道粘膜充血、水肿，发生支气管炎、肺炎等[10]。而且，鸡舍内的NH3会影响肉鸡的免疫功能，降低特异性抗体滴度和提高疾病易感性[8]，给肉鸡养殖业带来经济损失。但是，就目前为止，由畜舍空气质量直接影响畜产品品质及其质量安全的研究还很少见到报道，而本研究的结果为此直接提供了试验证据。并且，进一步验证了前人研究成果，即畜禽在NH3应激条件下，病原微生物容易侵入动物机体，增加了动物源性食品安全问题的风险。因此，本研究结果将加强畜牧工作者改善畜舍空气质量以保障肉鸡的生态养殖和健康可持续发展的决心，及为人民提供安全、绿色的动物源性肉制品奠定物质基础。

4 结论

在动物的生命和提供畜产品的生产活动中，除了遗传、营养、疫病防治外，环境因素也是重要的一环。环境因素会直接或间接影响畜禽养殖业，本研究从微生态角度入手，研究畜舍内空气环境质量对肉鸡呼吸道微生物的影响，研究结果证明了在高浓度NH3环境中，病原微生物会更容易定制于肉鸡机体内，从而揭示了畜舍空气质量引发鸡源肉食品的潜在安全风险及其机制。

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