低温淀粉酶菌种分离纯化与发酵生产研究

张勃，赵春海，霍宁波

（1.乳山市渔政监督管理站，山东威海264500；2.滨州职业学院，山东滨州256603）

随着世界环境污染的日益严重和能源危机的不断加剧，节能环保的科技项目日益受到重视，结合我国在全国范围内推行新旧动能转换，提升企业发展的科技水平。根据目前淀粉的应用领域和范围分析，低温淀粉酶可以在生产中替代中温和高温淀粉酶的应用领域，同时降低反应条件，避免了在酶解中对生产原料和其中不耐高温物质的破坏同时低温淀粉酶的工作环境也在一定程度上降低了对温度即能源的需求，使得低温淀粉酶在大规模生产领域优势明显，同时低温淀粉酶的活性条件容易实现，在环境处理中是一种高效生物治理方法[1]。

淀粉酶在以糖为原料的工业生产中应用非常广泛，可应用于多种酒类及酒精发酵，发酵食品中的催熟剂和动物饲养等行业。同时糖化酶在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值，受到国内外学者的高度重视。随着研究的深入对其酶学结构、作用机理、结构功能相关性等问题有了一定的了解，其应用领域和范围更加广泛[3-4]。

基于黄河三角洲区域特点，蕴育着独特的微生物资源，为了充分开发和利用本地区的微生物资源，发酵生产低温淀粉酶，有利于拓宽低温淀粉酶的生产来源，丰富低温淀粉酶家族成员，有利于对低温淀粉酶酶学性质的研究，不论是应用还是理论研究都具有重要意义。

1 材料与设备

1.1 采样及菌种

样品：滨州本地区土样、水样。

1.2 试剂

1）0.1 mol/L醋酸缓冲溶液（pH5.0～6.0）。

2）Somogyi氏试剂（酒石酸钾钠、Na2CO3、NaHCO3、CuSO4、钼酸铵、砷酸氢二钠）国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器设备

GTR16-2高速低温离心机：北京时代北利离心机有限公司；FA1004B电子分析天平：上海平轩科学仪器有限公司；CX21BIM-SET5显微镜：上海谱骞光学仪器有限公司；T6紫外分光光度计：上海添时科学仪器有限公司；ABI-2720PCR 仪：Applied Biosystems，美国。

1.4 培养基

平板筛选培养基：可溶性淀粉2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，琼脂2%，pH自然，115℃灭菌，30 min。

发酵培养基：葡萄糖1%，可溶性淀粉1%，蛋白胨2%，酵母粉1%，琼脂2%，pH自然，115℃灭菌30 min。

1.5 菌种的分离与筛选

1.5.1 菌株的初筛

样品→选择性培养基平板分离→最适生长温度测定→摇瓶筛选→菌株获得→酶活测定[2]

1.5.2 菌株的复筛

初筛的纯菌种培养于250 mL三角瓶中，发酵培养基72 h，进行酶活测定。

1.5.3 粗酶分离及酶活测定

淀粉酶活力测定是通过测定还原糖的增加进行测定。将经过震荡培养48 h后的发酵液离心，收集上清液测定酶活。将用醋酸缓冲溶液（pH5.0）制备的淀粉溶液作为底物。按照粗酶液与底物体积比1∶10比例混匀，50℃水解30 min后沸水浴中5 min终止反应。以Nelson—Somogyi方法测定还原糖浓度。酶解产生1.0 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活性单位（U/mL）[5]。

1.5.4 最适温度的选择

将分离的菌种接种在筛选平板上，将平板放置于不同温度条件下培养，3 d～4 d后观察，并在生长较为理想的平板上滴加碘液，根据显色挑出菌落在35℃继续培养，根据水解圈直径和菌落直径比值，确定发酵复筛的菌株。

1.5.5 菌种的鉴定[5]

1.5.5.1 形态观察

通过菌落形态、细胞形态进行初步鉴定。

将平板分离的单个菌落通过电子显微镜下观察细胞形状、大小、繁殖方式。

1.5.5.2 糖发酵测试

选择葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖和棉子糖进行试验。将质量体积百分含量为10.0%的糖溶液10 mL装在管中灭菌后使用，用注射器去定量的糖液分装于杜氏管，接种于试管中25℃～28℃下培养观察。菌种发酵糖后产气就会在杜氏小管顶端出现空管现象，既可以判定为阳性（+），反之为（-）。

1.5.5.3 碳源同化

测试碳源选择葡萄糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、纤维二糖、海藻糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、山梨糖和可溶性淀粉等。将菌种分别接种在含有0.5%唯一同化碳源的基础培养液中，25℃～28℃下培养，以葡萄糖和不加任何碳源的空白分别作对照，凡是能生长的判定为阳性（+），反之为阴性（-）[5]。

1.5.5.4 分子生物学鉴定

通过分离菌株的基因组中ITS测序结果，在GenBank数据库中进行同源比对与分析，并进行进化树绘制。

1.5.6 发酵条件的优化

进行菌种生长规律的测定，单因子发酵条件试验，并进行菌种产酶时间的探索研究。

2 结果

2.1 菌种的分离结果

2.1.1 平板菌落与淀粉水解

将初筛菌株分别接种在含有淀粉的平板上，28℃培养观察淀粉水解情况，结果如图1～图2所示。

图1 菌株Bz-11与Bz-25菌落与水解圈Fig.1 The colony and hydrolytic circle of Bz-11and Bz-25

图2 Bz-38与Bz-73菌落与水解圈Fig.2 The colony and hydrolytic circle of Bz-38 and Bz-73

图1、图2中分离的不同菌株在固体平板上都出现了水解圈，证明这些菌株可以生产胞外淀粉酶，但是菌株是否同时可以合成胞内淀粉酶、而且这些胞外酶是否为低温淀粉酶还需要进一步验证[7-8]。

部分初筛菌株在不同生长温度的透明圈与菌落直径比值见表1。

表1 不同菌株在不同温度下水解圈与菌落直径比值Table1 The ratio of hydrolytic circle to colony diameter from different strains at different temperatures

由表1 可知，Bz38 酶活最高，Bz11、Bz25、Bz38、Bz73相似；这些菌最适生长温度均在20℃左右，较常规报道使用的产酶微生物的培养温度低，与文献报道的产低温淀粉酶的低温微生物生长温度一致[9]。

2.1.2 发酵复筛结果

经过初筛得到 Bz11、Bz25、Bz38、Bz73，根据水解圈与菌落直径比值，选择了其中Bz11、Bz38两株相对较高菌株在20℃摇瓶液体发酵48 h，取发酵液离心后收集上清液即为粗酶液，进行酶活测定，结果如表2所示。

表2 2菌株发酵复筛结果Table 2 Rescreening results of strain fermentation

摇瓶液体发酵酶活分别为590 U/mL和660 U/mL，从平板固体培养与摇瓶液体发酵试验都证明了Bz38菌株产酶活性较高，因此选择野生型菌株Bz38作为产酶试验对象，进行鉴定与发酵研究。

为了验证淀粉酶的水解作用，分别以单糖、二糖、三糖为对照，以淀粉水解液为待测样品，进行层析色谱分析，结果如图3所示。

图3 葡萄糖淀粉酶酶解淀粉层析图Fig.3 The chromatography from glucoamylase hydrolyzed starch

由图3可知，淀粉酶水解层析试验，通过层析结果表明，分离菌株产生的淀粉酶可以将淀粉水解成不同大小分子[10-11]。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 生理和生化鉴定

将分离菌株划线于平板上，进行菌落观察如图4（A）所示，菌落表明光滑、整齐、湿润成乳白色；将分离菌株细胞在显微镜下观察图4（B）所示，部分细胞呈现大小两个连在一起的现象，典型酵母菌出芽生殖特征。

图4 Bz38菌落形态与细胞形态Fig.4 Bz38 colony morphology and cell morphology

酵母菌生理生化特性鉴定指标有碳源发酵测试、碳源同化、本试验筛选葡萄糖、麦芽糖等7种糖进行发酵试验（表3），选择葡萄糖、麦芽糖等12种糖进行碳源同化试验，结果见表3和表4。

表3 酵母菌BZ38的糖发酵试验结果Table 3 The results of BZ38 sugar fermentation test

表4 产酶菌株BZ38碳源同化试验Table 4 Carbon source assimilation test of strain Z38

酵母菌BZ38不能发酵利用常见糖类（表3），但是可以通过同化方式利用葡萄糖糖、麦芽糖、蔗糖（表4）等，与常见酵母菌碳源发酵、碳源同化结果一致。

2.2.2 分子生物学鉴定试验结果

为了进一步掌握确定菌株的分离地位，提取酵母BZ38菌株的基因组DNA，如图5所示，平行提取5组进行电泳检测，并通过酵母通用引物测定了其26S rDNA序列结果如图6所示，扩增片段大小为500 bp左右。将这个序列与GenBank数据库中其它酵母菌的26S rDNA序列进行比[5]。

图5 BZ38基因组DNA（1kb maker）Fig.5 The genome DNA of BZ38（1kb maker）

图6 26SrDNA PCR扩增结果（D2000maker）Fig.6 PCR amplification results from 26SrDNA（D2000maker）

为了进一步确定分离获得的菌株B38在微生物中的分类地位，在NCBI数据库和CBS菌种库中寻找出各个物种菌株的rDNA序列，与菌株的ITS序列经比对后，用MEGA6.0软件通过Neughbor-Joining法构建进化树，见图7。

图7 菌株BZ38 26S rDNA序列进化树结果Fig.7 Sequence evolution tree results of strain BZ38 26S rDNA

通过与已知鉴定的酵母菌标准菌株菌落和细胞形态相比，菌株BZ38解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）接近，通过ITS序列进行比对与进化树的结果进一步验证了形态与生理生化方法对株菌的鉴定，BZ38与解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）亲缘关系最为相近，下一步研究以BZ38为研究对象[12-13]。

2.3 发酵条件试验

2.3.1 生长曲线的测定

生产曲线是单细胞微生物特有的生长规律，为了准确掌握BZ38生长阶段规律变化，进行了生长曲线的测定，结果如图8所示。

图8 Bz38菌株成长曲线Fig.8 Growth curve of Bz38 strain

对菌种Bz38在YPD培养基上进行了生长曲线的测定，从图8可以看出生长规律基本符合单细胞微生物群体生长规律，生长曲线表明菌体12 h左右进入稳定期，为进一步发酵条件的优化奠定了基础。

2.3.2 单因子试验

2.3.2.1 碳源对产酶发酵的影响

在只改变原培养基碳源的情况下，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇5种糖做单一碳源时，浓度分别选10、15、20 g/L 3个浓度，考查不同碳源对产酶活性的影响，结果见表5。

表5 不同碳源条件对比酶活的影响Table 5 Effects of different carbon source conditions on enzyme activity

由表5可知，以酶OD值为主要指标，试验数据显示蔗糖酶为碳源时酶活性较大，其次是葡萄糖，麦芽糖、乳糖、甘露醇3种物质为碳源产酶时，酶浓度较低。结果也表明碳源对Bz38 Yarrowia lipolytica发酵的淀粉酶有很大影响[14]。

不同碳源种类试验中也表明同一种碳源不同浓度也会对酶活产生影响，选择了对酶活影响比较大的蔗糖和葡萄糖进行试验见图9。

图9 两种碳源不同浓度对产酶的影响Fig.9 Effects of different concentrations of two carbon sources on enzyme production

由图9所示，在一定浓度范围内随着碳源浓度增加，酶活力也随之提高，到了30 g/L，酶活性开始降低，可能是高浓度的糖，增加了发酵液的浓稠度，影响了菌体对氧气的利用，进而影响酶的合成和活性，补料发酵可以避免上述情况的发生。蔗糖对应的酶活比葡萄糖的高，成本又低，应选择蔗糖。考虑到20 g/L与25 g/L的酶活差不多，为了节省成本，所以选择20 g/L蔗糖。

2.3.2.2 氮源对产酶发酵的影响

有机氮源来源充足，但是微生物生长和很多大分子物质合成所必需，又是在酶代谢合成中，虽然有机氮源被微生物利用缓慢，但对培养基组成意义重大。

通过摇瓶试验已初步确定出碳源，所以把此试验结果用于优化氮源的试验中，即碳源改为25 g/L蔗糖。在选择有机氮源的试验中，分别选用了牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、尿素、酪蛋白胨、硫酸铵6种有机氮源。试验结果见表6。

表6 不同氮源对酶活的影响Table 6 Effects of different nitrogen sources on enzyme activity

从表6可以看出，选择酵母膏、牛肉膏作为氮源时酶活相对较高，其它几种有机氮源的酶活较低，确定酵母膏为有机氮源，同时考虑到微生物对氮源的利用分为迟效率氮源，和速效氮源，进一步增加硫酸铵作为下一步有机氮源配合使用的备选氮源。

3 结论

通过对黄河三角洲地区的土样中微生物的采集、分离获得了4株产葡萄糖淀粉较高的菌株：Bz11、Bz25、Bz38、Bz73，经过复筛最终选择产酶相对较高的Bz38作为研究对象进行研究，通过平板菌落观察、显微镜细胞观察，碳源发酵与同化试验、26srDNA分子生物学鉴定，最终确定为Bz38为解脂亚罗酵母菌。通过生长曲线测定掌握菌株生长规律的基础上，进行单因子碳源、氮源试验酶活达到960 U/mL，为全面应用葡萄糖淀粉酶奠定了坚实的力量基础，也极大的丰富了本地区对微生物种植资源的开发和利用。

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