丁香酚改性产物对葡萄采后保鲜的作用

李磊，易有金，*，夏菠，柏连阳，李高阳

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128；2.湖南省农业科学院，湖南长沙410128；3.湖南省农产品加工研究所，湖南长沙410128）

葡萄在运输过程中会发生腐烂、失水、果实软化等。防治葡萄腐烂的方法主要由物理方法、化学方法、涂膜保鲜法以及气调保鲜法[1]。目前市场上使用较多的是化学保鲜剂和冷冻贮藏方法，但是化学保鲜剂引发了一系列的安全问题，而冷冻贮藏保鲜则在耗能上造成的经济损失较大，因此，寻求新的贮藏保鲜方法更加符合绿色发展的主流趋势。

丁香酚在果蔬采后保鲜应用十分广泛，陈楚明[2]等就报道了丁香酚提取液可食膜对蜜桔采后保鲜的研究，证实了丁香酚对果实品质无不良影响且能诱导多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的活性上升的优点；郭艳峰[3]的研究表明，丁香酚对圣女果采后保鲜也有延迟腐烂的影响；陆漓[4]发现了丁香精油改性聚乙烯（polyethylene，PE）膜能够有效延长草莓的货架期。丁香酚对植物致病真菌有广谱抑菌效果和较强的抗氧化性[5]，但是丁香酚改性产物在果蔬采后保鲜方面应用较少。

国内外通过对丁香酚进行结构修饰，改性丁香酚生成新的产物研究广泛[6]。本试验采用丁香酚改性产物制备成复合保鲜剂，浸泡巨峰葡萄，研究对葡萄保鲜的效果，为丁香酚改性保鲜剂保鲜采后葡萄提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄采自于湖南农业大学实验基地，品种为巨峰，采后立即存放至实验室并选取大小一致、颜色一致、无病虫害、无机械损伤、成熟度一致的葡萄果实；漆酶、阿拉伯半乳糖、丁香酚（纯度99.26%）：成都曼思特生物科技有限公司；保鲜剂NW20（生化级）、吐温20、无水乙醇、氯化钡、酚酞、抗坏血酸、2，6-二氯酚靛酚、愈创木酚（均为分析纯）、草酸、冰醋酸：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LRH-250智能生化培养箱：上海飞跃实验仪器有限公司；WFJ7200可见分光光度计：尤尼柯仪器公司；PAL-1手持糖度计：ATAGO（爱拓）中国分公司；GF16RX冷冻离心机：日本日立公司；DK-S28水浴锅：上海惊宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香酚改性产物的制备

采用响应面试验法优化改性试验条件，以最佳试验条件进行改性。先配制乙酸/乙酸钠缓冲液（pH 6.8）8 mL，加入1 mL丁香酚、1 mL乙醇混合充分溶解，再加入1 g阿拉伯半乳糖与漆酶（10 U/mL）100 mg混合均匀，将体系于35℃水浴中反应，整个反应过程中需通入无菌空气，反应时间为4.5 d，反应结束后冷冻离心取上清液为改性产物。改性反应体系为乙酸/乙酸钠缓冲液（pH6.8）8 mL，吐温-20 1 mL，乙醇 1 mL，阿拉伯半乳糖1 g。

1.3.2 保鲜剂的制备

改性产物保鲜剂：取50 mL改性产物融入2 mL 50%乙醇中，加入2.25 g普鲁兰多糖，5.5 g CaCl2，定容至500 mL，冷藏备用，使用时加入0.1%的吐温。

丁香酚保鲜剂：取改性反应体系45 mL，加入丁香酚5 mL，改性反应体系中无漆酶，离心处理后取上清液50 mL，加入2 mL 50%乙醇、2.25 g普鲁兰多糖和5.5 g CaCl2，定容至500 mL，冷藏备用，使用时加入0.1%的吐温。

空白保鲜剂：取改性反应体系50 mL，加入2 mL 50%乙醇、2.25 g普鲁兰多糖和5.5 g CaCl2，冷藏备用，使用时加入0.1%的吐温。

阳性对照组：保鲜剂NW20。

1.3.3 保鲜处理方法

用保鲜剂浸泡葡萄3 min，将其自然晾干，再装入0.03 mm PE保鲜袋中，规格为25 cm×38 cm，于湿度为75%的人工气候箱中贮存，贮存温度为15℃。（1）单因素试验和正交试验每袋中放入30颗葡萄，每组重复3次，25天后测定失重率和腐烂率；（2）对葡萄采后保鲜效果试验中每袋放入60颗葡萄，每组处理设3次重复，每5天取样进行各指标的测定。

1.3.4 丁香酚改性保鲜剂对葡萄采后保鲜效果的影响

以丁香酚改性产物制备为丁香酚改性保鲜剂组；以空白保鲜剂处理为CK1组，以丁香酚保鲜剂处理为CK2组，以保鲜剂NW20处理为CK3组，每5天取样对各指标进行测定，分析最佳丁香酚改性保鲜剂对葡萄采后保鲜效果的影响。

1.3.5 葡萄相关指标的测定方法

1.3.5.1 失重率测定方法

式中：W为处理第n天后的质量损失率，%；m0为原始质量，g；mn为贮藏第n天后的质量，g。

1.3.5.2 腐烂率测定方法

腐烂率/%=腐烂果实数/总果实数×100

1.3.5.3 呼吸强度测定方法

采用静置法[7]。

1.3.5.4 POD（过氧化物酶）活性测定方法

参照曹建康[8]的方法并改进。

1.3.5.5 PPO（多酚氧化酶）活性测定方法

参照曹建康[8]的方法并改进。

1.3.5.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定方法

参照曹建康[8]的方法并改进。

1.3.5.7 可溶性固形物测定方法

手持折光仪测定方法[8]。

1.3.5.8 还原糖含量测定方法

采用斐林试剂法测定[8]。

1.3.5.9 VC的测定方法

采用2，6-二氯酚靓酚滴定法[8]。

1.3.6 数据处理及分析

检测数据采用Origin9软件进行图表处理，采用SPSS 11.0软件进行LSD数据分析。

2 结果与分析

2.1 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄失重率的影响

不同处理对葡萄失重率的影响见图1。

图1 不同处理对葡萄失重率的影响Fig.1 Effect of different treatments on weight loss rata of grape

失重率直接影响到葡萄果实的新鲜度和风味[9]，由图1可知，贮藏时间越长，葡萄的失重率越高，在葡萄采后保存的过程中，由于葡萄脱离了植株和土壤，缺少营养与水分的补给，葡萄的代谢作用仍在持续，使得水分消耗和果实内物质持续耗损，导致葡萄重量减轻，在果实贮藏后期，耗损现象尤为明显，这于果实内部组织衰老有关。在贮藏25 d时，CK1失重率达到16.24%，丁香酚改性保鲜剂处理组失重率达到6.08%，处理后的质量损失率有降低，且显著低于CK1（P<0.05），与 CK2和 CK3比较均有显著性（P<0.05），说明丁香酚改性保鲜剂能有效延缓葡萄果实质量损失。

2.2 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄腐烂率的影响

不同处理对葡萄腐烂率的影响见图2。

图2 不同处理对葡萄腐烂率的影响Fig.2 Effect of different treatments on weight decay of grape

腐烂率是能够最直观得观察出葡萄保鲜效果，腐烂率随着贮藏时间的延长升高，致腐作用主要是由于葡萄果实真菌的生长，同时加快果实自身代谢，加速了腐败速度[10]。由图2可知，改性保鲜剂处理组的腐烂率增长缓慢，明显低于CK1，差异极显著（P<0.01），贮藏25 d时，CK1的腐烂率为18.42%，改性保鲜剂处理组腐烂率为6.14%，CK3腐烂率为14.26%，CK2腐烂率为10.98%，说明改性保鲜剂处理对葡萄采后贮藏腐烂率的抑制效果最佳。

2.3 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄呼吸强度的影响

不同处理对葡萄呼吸强度的影响见图3。

图3 不同处理对葡萄呼吸强度的影响Fig.3 Effect of different treatments on respiration intensity rata of grape

呼吸强度是新陈代谢的主要指标[11]，能够看出果实衰老的程度，巨峰葡萄果粒为非跃变型，在采后成熟过程中呼吸作用变动率不形成呼吸高峰，变动平缓，随着贮藏时间的延长，呼吸强度逐渐减弱，前期减弱趋势大，贮藏后期减弱趋势平缓[12]。由图3可知，在贮藏25 d后，CK1的呼吸强度为17.31 mg·CO2/（g·h），低于改性保鲜剂处理组呼吸强度29.42 mg·CO2/（g·h），方差分析有显著性差异（P<0.05），改性保鲜剂处理组的呼吸强度在整个贮藏过程中始终高于CK组，CK2呼吸强度为25.17 mg·CO2/（g·h），CK3呼吸强度为21.45 mg·CO2/（g·h），数据表明，丁香酚改性保鲜剂对呼吸强度的延缓作用最佳。

2.4 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄可溶性固形物的影响

不同处理对葡萄可溶性固形物含量的影响见图4。

图4 不同处理对葡萄可溶性固形物含量的影响Fig.4 Effect of different treatments on soluble solids content in grape

由图4可知，巨峰葡萄在整个贮藏期间可溶性固形物含量呈降低趋势，SANCHEZ-GONZALEZ L[13]的试验中也有同样的趋势，VALERO D[14]也得到了相同的试验趋势，经丁香酚改性保鲜剂处理后的葡萄其可溶性固形物的降低率低于CK1，在贮藏25天后，经分析显示，丁香酚改性保鲜剂处理组与CK1的可溶性固形物含量呈显著性差异（P<0.05），其中，改性保鲜剂处理后的可溶性固形物含量为13.37%，与贮藏前比较降低了2.56%；CK1可溶性固形物含量为3.67%，与贮藏前比较降低了12.26%；CK2可溶性固形物含量为10.17%，与贮藏前比较降低了5.76%；CK3可溶性固形物含量为8.53%，与贮藏前比较降低了7.4%。由数据可知，丁香酚改性保鲜剂对巨峰葡萄可溶性固形物的降低率延缓效果最佳。

2.5 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄维生素C含量的影响

不同处理对葡萄VC含量的影响见图5。

图5 不同处理对葡萄VC含量的影响Fig.5 Effect of different treatments on vitamin C content in grape

新鲜的巨峰葡萄VC含量约为8 mg/100 g，随着采摘后贮藏时间的延长，葡萄果实内VC在贮藏阶段逐渐被氧化分解，加上环境因素，如氧气和温度加速了果实内VC的氧化，失去生理活性，VC含量是果实成熟程度的生理标志之一[15]。由图5可知，整个贮藏过程中，贮藏前期VC的降低速度较快，贮藏后期VC下降速度相对平缓，其中，在贮藏25 d后，CK1的VC含量为0.93 mg/100 g，相较于贮藏前降低了88.82%；CK2的VC含量为3.04 mg/100 g，相较于贮藏前降低了63.46%；丁香酚改性保鲜剂处理组VC含量为3.64 mg/100 g，相较于贮藏前降低了56.25%；CK3处理后VC含量为2.93 mg/100 g，相较于贮藏前降低了64.78%。CK1的VC含量低于丁香改性保鲜剂组VC含量，经方差分析由显著性差异（P<0.05）。由数据可看出，丁香酚改性保鲜剂对VC含量的降低延缓效果最佳。

2.6 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄MDA的影响

不同处理对葡萄MDA含量的影响见图6。

图6 不同处理对葡萄MDA含量的影响Fig.6 Effect of different treatments on MDA content in grape

丙二醛是膜脂过氧化的主要产物，是葡萄果实组织衰老和膜脂过氧化强弱的重要标志之一，保鲜剂能够一定程度减缓自由基的发生，通过减弱活性氧对膜脂的损害和减少丙二醛的增长率延缓果实衰老[16]。由图6可知，葡萄果实在贮藏期间丙二醛含量随贮藏时间的延长而增加，贮藏25d时，CK1的MDA含量为14.08 μmol/g，CK2 处理 MDA 含量为 10.32 μmol/g，丁香酚改性保鲜剂处理MDA含量为8.93 μmol/g，CK3的MDA含量为11.93 μmol/g。CK1处理后MDA含量低于丁香酚改性保鲜剂含量，方差分析显著性（P＜0.05），且数据显示，丁香酚改性保鲜剂处理对葡萄MDA的增加延缓效果最佳。

2.7 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄还原糖的影响

不同处理对葡萄还原糖含量的影响见图7。

图7 不同处理对葡萄还原糖含量的影响Fig.7 Effect of different treatments on reducing sugar content in grape

根据图7显示可知，整个贮藏过程中还原糖含量呈现降低趋势，丁香酚改性保鲜剂处理组的降低趋势相对低于CK1处理组，CK1在贮藏10 d后降低幅度有所增加，贮藏第25天时还原糖损失达到55.24%，而CK2在25 d时还原糖损失达到29.81%。CK1还原糖含量低于丁香酚，有显著性差异（P＜0.05）。

2.8 丁香酚改性产物保鲜剂对葡萄过氧化物酶POD活性的影响

不同处理对葡萄过氧化物酶活性的影响见图8。

图8 不同处理对葡萄过氧化物酶活性的影响Fig.8 Effect of different treatments on peroxidase activity in grape

POD在葡萄果实内有延缓衰老和促进果实褐变的作用，对果实保鲜的作用比较复杂，一般作为果实衰老的指标[17]。由图8可知，不同处理对葡萄POD的影响有所不同，在贮藏第10天时，CK1的POD含量上升到峰值，之后开始下降；其他处理组在贮藏第15天达到峰值，再趋于下降。第25 d时，CK1处理的葡萄POD含量为8.93 U/（g·min），CK2为10.13 U/（g·min），丁香酚改性保鲜剂处理为10.64 U/（g·min），CK3为12.78 U/（g·min），CK3高于其他3组，差异显著（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，保鲜剂处理组POD含量均高于CK1，保鲜剂中可能含有促进POD活性的物质，在贮藏过程中，通过促进POD的活性来消除果实中H2O2以达到保护果实效果。

2.9 丁香酚改性产物保鲜剂对多酚氧化酶PPO活性的影响

不同处理对葡萄多酚氧化酶活性的影响见图9。

图9 不同处理对葡萄多酚氧化酶活性的影响Fig.9 Effects of different treatments on polyphenol oxidase activity in grape

PPO可将葡萄果实内的酚类物质氧化成为醌类物质，醌类物质进一步聚合形成褐色素，最终将导致果实发生褐变，由图9可知，贮藏过程中，PPO活性持续上升，丁香酚改性保鲜剂处理在贮藏前期上升幅度最大，在第15天时开始减缓；在第25天时，CK2的PPO含量为3.13 U/（g·min），与丁香酚改性保鲜剂处理组的PPO含量为3.17 U/（g·min）比较无显著性差异（P＞0.05），与CK1的4.37 U/（g·min）相比有显著性差异（P＜0.05），可知丁香酚改性保鲜剂能够抑制PPO的活性，一定程度上延缓果实褐变。

3 结论

葡萄果实经过丁香酚改性保鲜剂处理贮藏25天后，能够显著降低葡萄果实的营养损失。葡萄果粒在采后生理具有呼吸作用旺盛、蒸腾失水较快、易感染真菌病害导致腐败的特点，果实在采后仍然进行着一系列的生理生化活动，如VC、可溶性固形物、还原糖等都在进行着消耗和转化。果实内部分防御酶的活性反映出果实细胞对外界病害抗性的能力，丙二醛（MDA）是细胞过氧化的产物之一，随着细胞的衰老会逐渐积累，丁香酚保鲜剂复合膜在贮藏期间能够有效地抑制贮藏期间丙二醛（MDA）的积累，这与于艳梅[18]的结果相似。

经过对比后发现，经过改性保鲜剂处理后的葡萄经过25 d的贮藏后风味品质最佳，失重率仅为6.08%，腐烂率为6.14%，呼吸强度为29.42 mg·CO2/（g·h），可溶性固形物含量为13.37%，VC含量为3.64 mg/100 g，MDA含量为8.93 μmol/g，还原糖含量为9.63 g/100 g，POD酶活性为10.13 U/（g·min），PPO酶活性为3.17 U/（g·min）。其中与相同贮藏条件下的胡晓亮[19]的研究失重率9.34%对比要低3.26%，说明可有效延缓果粒呼吸内耗、抑制蒸腾作用、阻止贮藏过程中真菌的侵染，并能够一定程度上防止机械损伤，丙二醛含量比曾顺德[20]的试验结果比较在25 d时要低3.16 mg/g，说明丁香酚改性保鲜剂能够有效延缓MDA的增加，一定程度上抑制果实内部自由基的发生，延缓衰老。POD酶和PPO酶的活性能够反映出果实衰老的程度，贮藏25天后，丁香酚改性保鲜剂处理后POD酶活性高于CK1和CK2，但低于阳性对照组，PPO酶活性低于CK1和CK3，高于CK2，说明丁香酚改性保鲜剂处理葡萄后对葡萄防御酶的降低有一定的延缓作用。

试验结果表明：用3 min、贮藏温度10℃、丁香酚改性产物保鲜剂浓度5%、乳化剂浓度0.1%的试验条件对葡萄进行贮藏保鲜，能较好地维持葡萄的营养价值和商业价值，提高巨峰葡萄的贮藏效果，丁香酚改性产物的保鲜效果优于丁香酚和NW20保鲜剂。

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