微波辅助萃取枸杞中类胡萝卜素技术及其抗氧化活性研究

郑坚强，司俊玲，宋佳旭，李红，吴晓宗，彭新榜

（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002）

类胡萝卜素（carotenoids）广泛存在于各种果蔬中，是一种脂溶性天然色素的总称。种类不同会呈现出不同颜色，通常为黄色、橙红色或红色，是着色能力强的天然色素，由于其具有安全性高、可靠性高、颜色自然等特点，因此受到食品行业青睐[1-2]。类胡萝卜素一般由8个类异戊二烯单位组成，有抗氧化作用，同时还有抗癌、预防夜盲症等功效[3-4]，人们对它的需求也越来越多。其中，类胡萝卜素中的叶黄素的抗氧化活性较高[5]。由于类胡萝卜素对光、热、氧等条件比较敏感，稳定性较差，所以对于类胡萝卜素的萃取，从十九世纪以来一直是研究热点，科技工作者始终致力于研究更好的萃取技术[6]。

微波辅助萃取法利用温度将类胡萝卜素更好的溶于溶剂中，有利于提高萃取得率。该方法不适宜挥发性较强的有机溶剂，微波辅助时间不宜过长[7]。采用超声波辅助萃取可以使动植物细胞受到严重的损坏，提高细胞膜和细胞壁的通透性，能够促使细胞破裂进而使细胞中的类胡萝卜素更充分的溶在溶剂中，有助于类胡萝卜素溶出[8-9]。

类胡萝卜素的抗氧化机制主要有猝灭单线态氧、消除自由基、防止低密度脂蛋白氧化三种方式。类胡萝卜素通过淬灭单线态氧，从而防止单线态氧引起的脂质过氧化[10]。

枸杞中富含丰富的类胡萝卜素。对枸杞中的类胡萝卜素的萃取研究，为研究枸杞中小分子物质做铺垫，也可以将该方法运用在其他水果蔬菜中萃取天然色素，研究结果对色素的萃取提供研究参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

枸杞（绿蒂品种，宁夏）：食品级，低温贮藏。

1.1.2 试剂

无水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；1-1-二苯基-2-苦基肼自由基：梯希爱化成工业发展有限公司。

1.1.3 仪器与设备

MCR-3常压微波辅助化学反应器：上海予正仪器设备有限公司；WF-126高速多功能粉碎机：上海冰都电器有限公司；LY23-16S水浴锅：上海麦尚科学仪器有限公司；SB25-12DTD超声波萃取机：宁波新芝生物科技股份有限公司；NA 2SGS旋转蒸发仪：成都胜拓仪器有限公司：HC-02H真空泵：杭州海驰科技有限公司；V-1600PC紫外分光光度计：上海美普达仪器有限公司；FD-1真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；DLSB-5-20低温冷却循环泵：郑州凯鹏实验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 枸杞冷冻干燥

采用真空冷冻干燥（真空度-0.20 MPa，冷冻干燥时间12 h，温度-40℃），降低枸杞水分含量，处理后进行粉碎。枸杞物料颗粒变小会增大枸杞和有机溶剂的接触面积，能够充分的与有机溶剂混合，有利于萃取，节约时间。粉碎时间约10 s。粉碎的枸杞粉末后装入密封袋，低温、避光贮藏。

1.2.2 类胡萝卜素的萃取方法

1.2.2.1 微波辅助萃取法

微波辅助萃取法是在有机溶剂萃取法的基础上，通过微波辅助处理的一种改进方法。微波辅助萃取时，固定了240 W的微波辅助功率，萃取温度分别为30、40、50 ℃；萃取时间分别为 5、10、15 min；料液比分别为 1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）。然后按照响应优化设计进行试验。萃取溶液进行抽滤，然后定容500 mL的容量瓶中，在450 nm处测定其吸光度，按照公式1的计算萃取的类胡萝卜素含量[10]。

式中：M为萃取的类胡萝卜素的含量，mg/100g；A为在450 nm测得的类胡萝卜素的吸光度；v为样品液定容体积，mL；n为稀释定容后的倍数；m1为实际称取的枸杞质量，g；2 480为1 cm光程长的比色杯中1 g/L枸杞样品萃取液的理论吸收值（按玉米黄素记）。

1.2.2.2 超声波萃取法

试验中温度和时间两个因素。温度为30、40、50℃；萃取时间为5、10、15 min。萃取溶液定容，测定其吸光度，按照公式1的计算类胡萝卜素的含量。

1.2.2.3 抗氧化活性的测定

1）DPPH溶液的配置：准确称取DPPH粉末3.94mg，加入具塞棕色锥形瓶中，加入100.00 mL无水乙醇，摇匀，得到浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液。避光贮存。

2）DPPH自由基清除率的测定：准备4个试管，分别标注A样品、A对照、A空白。吸取配置DPPH溶液2.00 mL分别加入A样品和A对照试管中，再吸取2.00 mL无水乙醇溶液分别加入A空白和空白试管中，吸取萃取样品溶液2.00 mL分别加入A样品和A空白试管中，振荡后置于暗处反应30 min后，在517 nm处分别测定A样品、A空白、A对照的吸光度。然后根据公式2计算出萃取的类胡萝卜素的自由基清除率K，表明类胡萝卜素的抗氧化活性效果[10]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取液的配比对萃取类胡萝卜素的影响

不同浓度的萃取液对萃取枸杞中类胡萝卜素的含量结果，如图1所示。

图1 不同有机溶液的配比对萃取类胡萝卜素影响Fig.1 Effect of different organic solutions on extraction of carotenoids

从图1看出，甲醇∶无水乙醇为2∶1（体积比）时效果较差，随着无水乙醇、比重越大，有机溶剂萃取的效果越好。当甲醇∶无水乙醇=1∶2（体积比）时基本稳定，并且发现，再增加无水乙醇的比重，萃取效果没有明显变化。

2.1.2 料液比对萃取类胡萝卜素的影响

不同料液比对萃取类胡萝卜素含量的影响结果，如图2所示。

图2 不同料液比对萃取类胡萝卜素含量的影响结果Fig.2 Effect of different ratio of solid to liquid on the extraction of carotenoids

如图2 所示，料液比在 1 ∶10（g/mL）到1 ∶15（g/mL）之间效果最好。料液比为1∶5（g/mL）时有机溶剂较少，枸杞较多，萃取的类胡萝卜素达到饱和，枸杞中还有部分类胡萝卜素没有溶解到有机溶剂中，造成萃取损失。当料液比在1∶20（g/mL）之后，由于有机溶剂的增加，与枸杞接触的有机溶剂也随之增加，增大萃取的含量，但溶剂过多，造成枸杞与有机溶剂接触不完全，有机溶剂越多，挥发越大，所以在料液比1∶20（g/mL）之后萃取效果反而下降。

2.1.3 萃取时间对萃取类胡萝卜素的影响

萃取时间对萃取枸杞中的类胡萝卜素的影响结果，如图3所示。

图3 不同萃取时间对萃取类胡萝卜素含量的影响结果Fig.3 The effect of different extraction time on the extraction of carotenoids content results

由图3看出，随着萃取时间的增加，萃取类胡萝卜素呈上升后下降的趋势。时间越长，由于有机溶剂的挥发会导致萃取效果下降。

其实，这跟年岁一点关系都没有。央视有个足球评论员叫张路，说球说了三十多年。我小时候，他就在激情澎湃地说意甲，如今还在激情澎湃地说球，一口气说出那么多球员的名字，这得多好的记忆力啊。老了的张路先生，依然显得年轻，依然帅气，也只有活在自我情趣中的人，才会这么年轻吧。

2.1.4 萃取温度对萃取类胡萝卜素的影响

萃取温度对萃取枸杞中类胡萝卜素的影响结果，如图4所示。

由图4看出，随着温度的升高，萃取的类胡萝卜素的含量也逐渐增加。但考虑到有机溶剂的沸点、易挥发性，试验选择60℃。温度越高分子的扩散速度越快，分子的运动也加剧，所以温度越高萃取效果越好。

图4 不同萃取温度对萃取类胡萝卜素的含量的影响结果Fig.4 Different extraction temperature on the extraction of carotenoids results

2.2 响应面设计微波辅助萃取试验结果

采用Design-Expert 8.0软件中的中心组合试验（box-behnken design，BBD）原理。选取微波辅助萃取时间（min）、温度（℃）、料液比（g/mL），以测得的类胡萝卜素含量为响应值，进行三因素三水平的响应面试验，见表1。

表1 微波辅助萃取响应面分析法的因素与水平表Table 1 Microwave extraction response surface analysis of the factors and level table

得到萃取的类胡萝卜素含量对萃取温度（℃）、萃取时间（min）、料液比（g/mL）的回归方程类胡萝卜素含量=66.60+0.31X1-0.052X2-0.54X3-1.16X1X2-0.80X1X3+1.67X2X3-1.92X12-2.27X22-2.9X32

表2 试验设计与数据分析Table 2 Experimental design and data analysis

续表2 试验设计与数据分析Continue table 2 Experimental design and data analysis

模型中二次项中X32较为显著，表明模型中萃取的温度对萃取枸杞中的类胡萝卜素有较显著的影响。表中P失拟项＜0.05说明模拟失拟度较为显著。模型中的调整确定系数RAdj=0.953 4，说明该模型能解释95.34%响应值的变化。得出的优化最佳条件为萃取时间 10 min，萃取温度 45 ℃，料液比 1 ∶15（g/mL），测得类胡萝卜素含量为69.05 mg/100 g，优化条件下的萃取含量略微提升。

表3 微波辅助萃取方差分析表Table 3 Microwave extraction analysis of variance table

固定料液比时，温度与时间的交互作用对萃取类胡萝卜素的影响见图5。

图5 温度和时间响应曲面图Fig.5 Surface map of temperature and time response

图6 料液比与时间响应曲面图Fig.6 Liquid ratio and time response surface map

从图6中可以看出，在萃取温度固定时，料液比与时间对萃取枸杞中类胡萝卜素含量的影响作用。在料液比固定时，随着时间的增加，类胡萝卜素萃取的含量也增加。在时间固定时，随着料液比的增加，类胡萝卜素的含量呈先上升后下降的趋势。料液比与时间对提取类胡萝卜素含量的影响见图7。

图7 料液比与温度响应曲面图Fig.7 Liquid ratio and temperature response surface

从图7中可以观察出，在萃取时间固定时，料液比与温度的交互作用下对萃取枸杞中类胡萝卜素的影响。在萃取时间固定时，料液比不变时，随着萃取温度的升高，萃取的类胡萝卜素含量先上升后下降。在萃取温度不变时，随着料液比的增加萃取的类胡萝卜素含量下降。

2.3 超声波萃取结果

按照1.2.2.2方法，采用超声波辅助萃取，萃取得到的类胡萝卜素含量结果如表4所示。

表4 超声波萃取类胡萝卜素含量结果Table 4 The result of ultrasonic extraction of carotenoid content

从表4可以看出，随着时间的增加萃取的类胡萝卜素含量呈现一个上升的趋势。在萃取时间不变时，随着萃取温度的提升，萃取的含量也明显增加。

2.4 自由基清除率的测定结果

按照1.2.2.3方法，采用微波辅助萃取法 [工艺参数：萃取温度45℃，萃取时间10 min，料液比1∶15（g/mL），甲醇 ∶无水乙醇（体积比）=1∶2]，获得类胡萝卜素的自由基清除率为95.22%，而采用超声波萃取法[技术参数：萃取温度50℃，萃取时间15 min，料液比1 ∶15（g/mL），甲醇 ∶无水乙醇（体积比）=1∶2]，获得类胡萝卜素的自由基清除率为89.46%。主要原因是超声波作用下，产生了“空化现象”，水分子裂解产生了H·和OH·等自由基，加速了类胡萝卜素的氧化进程。

3 结论

试验在单因素的基础上通过正交试验、响应面优化试验可以得到最适合萃取类胡萝卜素的工艺条件。通过响应优化试验，得出微波辅助萃取最佳条件为：萃取温度45℃，萃取时间 10 min，料液比 1∶15（g/mL），甲醇∶无水乙醇（体积比）=1∶2（体积比）。

通过抗氧化活性的测定，微波辅助萃取法得到的类胡萝卜素自由基清除率为95.22%。表明枸杞中类胡萝卜素具有很好的抗氧化能力，研究数据进一步说明了枸杞中类胡萝卜素作为抗氧化活性物质，具有很好应用前景。

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