连香树水提物和乙醇提取物的体外抗氧化研究

杨添雁 沙秀芬 魏琴 李群

摘 要：為了探究连香树水提物和乙醇提取物的主要成分和抗氧化作用，该研究采用水提和醇提两种方法提取连香树叶片中的代谢物并测定其主要成分，通过体外抗氧化实验，即清除羟自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）、超氧阴离子（O2-·）和还原铁离子（Fe3+）的能力等四个指标来评价其抗氧化作用。结果表明：连香树水提物和乙醇提取物中均含有山萘酚。此外，水提物中还含有苜蓿素和异槲皮苷等黄酮类物质;乙醇提取物中还含有柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类物质。水提物和乙醇提取物均有清除羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子及还原三价铁离子的能力。抗氧化的作用随提取物浓度的增大而增强，其中清除超氧阴离子（IC50值分别为0.092、0.002 mg·mL-1）的能力强于阳性对照Vc（IC50值为0.241 mg·mL-1）且铁离子还原力的IC50值（水提物为0.014 mg·mL-1，乙醇提取物为0.001 mg·mL-1）相对较小，说明其总抗氧化活性较强。由此可见，连香树水提物和乙醇提取物均具有良好的抗氧化作用，可作为一种潜在的天然抗氧化剂。

关键词：连香树， 水提物， 乙醇提取物， 抗氧化作用

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2018）11-1512-10

Abstract：In order to study on the main components and antioxidation of Cercidiphyllum japonicum aqueous extract and ethanol extract， the secondary metabolites of C. japonicum leaf were extracted by aqueous extraction and ethanol extraction and the main components of aqueous extract and ethanol extract of C. japonicum were determined. The antioxidant effects of aqueous extract and ethanol extract of C. japonicum were evaluated by in vitro antioxidant assays， such as the ability of scavenging hydroxyl radical （·OH）， the ability of scavenging DPPH free radical （DPPH·）， the ability of scavenging superoxide anion （O2-·） and the ability of reducing iron ion （Fe3+）. The results showed that the main components of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum both contain kaempferol. In addition， the main components of the aqueous extract of C. japonicum also contained flavonoids such as alfalfa and isoquercetin， and the main components of the ethanol extract of C. japonicum also contained flavonoids such as naringin and quercetin 3-O- β -dglucoside. The aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum both had the ability of scavenge hydroxyl radicals， DPPH free radicals， superoxide anions and the ability of reducing iron ion. The antioxidant effects of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum increased with the increasing concentrations， which was dose-dependent. Speci-fically， the ability of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum to scavenge superoxide anion （IC50 values were 0.092 mg·mL-1 and 0.002 mg·mL-1 respectively） was stronger than that of positive control Vc （IC50 value was 0.241 mg·mL-1）. Furthermore， the IC50 value of the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum on iron ion reducing power was relatively small （the IC50 value of the aqueous extract was 0.014 mg·mL-1; the IC50 value of the ethanol extract was 0.001 mg·mL-1）， which indicated that the total antioxidant activity of C. japonicum extracts were strong. It can be seen that the aqueous extract and the ethanol extract of C. japonicum both have good antioxidant effects， and it can be used as a potential source of natural antioxidants.

Key words：Cercidiphyllum japonicum， aqueous extract， ethanol extract， antioxidant

连香树（Cercidiphyllum japonicum）别名山白果，是连香树科连香树属的一种古老稀有的落叶大乔木，被国家列为二级保护植物（姚连芳和李宏瀛，2005），主要分布在日本和我国四川西部和东南部、山西南部、湖北西部等海拔400～2 500 m的常綠和落叶阔叶混交林中（黄绍辉，2007）。连香树其味芳香，百米可闻。树姿高大雄伟，叶型对称美观（郭郢和王安明，2004）。根、茎、叶均可作药用，特别是树皮煎水饮服，对治疗感冒、痢疾有特殊疗效（陈仲平，2005）。树皮和叶均含有鞣质，可提取烤胶（姚连芳和李宏瀛，2005）。因此，连香树具有较高的观赏价值和经济价值。目前对连香树的研究报道大多是关于通过组培、快速繁殖（麦苗苗，2006;袁丽洁，2008;陈荣珠等，2012）等方法来恢复扩大其资源，而连香树次生代谢产物及其功能开发等方面的研究还不够完整，特别是抗氧化、抗癌等方面的研究尤为少见。该文拟对连香树叶片次生代谢物的主要成分及成分的抗氧化作用情况做一探索。

天然植物抗氧化剂是一类无毒、安全的抗氧化剂，具有重要的生物活性（张泽生等，2017）。它能有效清除机体受到氧化应激时产生的过多的自由基，使机体的氧化还原系统处于动态平衡（温朋飞和彭艳，2017）。研究表明，传统合成的抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）等本身可能具有潜在毒性，对人体造成危害，所以寻找低毒、安全、高效的天然植物抗氧化剂成为了一种必然趋势（熊皓平等，2001）。目前，许多植物的提取物均具有良好的抗氧化作用，且不同方法、不同溶剂的提取物其抗氧化作用不同（李海亮等，2017;袁保刚等，2011;潘争红等，2016）。该文旨在以连香树叶片为试材，通过水提和醇提两种方法获取提取液并测定其中的主要成分，分别对两种提取液进行体外测定羟自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）和超氧阴离子（O2-·）三种自由基的清除实验和三价铁离子（Fe3+）的还原力来研究连香树叶片提取物的抗氧化作用，为进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集与制备 连香树（Cercidiphyllum japonicum）：2017年7月中旬采自海拔1 800 m的四川省广元市旺苍县盐井河采育场，经四川师范大学生命科学学院马丹炜教授鉴定确认为连香树（Cercidiphyllum japonicum）。在实验室将叶子摘取下来后粉碎至粉末，备用。

1.1.2 试剂 硫酸亚铁（FeSO4），过氧化氢（H2O2， 0.3%），三羟甲基氨基甲烷（Tris），盐酸（HCl），邻苯三酚（1，2，3-Trihydroxybenzene），1，1-二苯基-2-苦苯肼自由（1，1-Diphenyl-2-picryhydrazyl， DPPH），铁氰化钾[K3Fe（CN）6]，磷酸二氢钠（NaH2PO4），磷酸氢二钠（Na2HPO4），氯化钠（NaCl），三氯乙酸（TCA），氯化铁（FeCl3），抗坏血酸（Vc），二甲基亚砜（DMSO），无水乙醇，95%乙醇。

1.1.3 主要仪器 AR224CN电子天平，上海奥赛斯仪器有限公司;XH-300A祥皓电脑超声波组合合成/萃取仪，北京祥皓科技发展有限公司;RE-52CS旋转蒸发仪，上海雅荣生化设备仪器有限公司;CHASHB-3A循环水式多用真空泵，北京恒奥德科技有限公司;HH-4恒温水浴锅，江苏金城国胜实验仪器厂;TGL-16B离心机，上海安亭科技仪器厂;多功能细胞分析仪（MD/Spectra Max M2）;老本行400Y粉碎机;色质联用仪（Waters XevoG2-XS Tof）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

1.2.1.1 连香树水提物的制备 水煎法（史文青等，2012），称取1 150 g连香树叶粉末，加入蒸馏水3 200 mL（1∶3），浸泡8 h后文火煎煮4 h，过滤得水提取液500 mL，得率为15.62%。

1.2.1.2 连香树乙醇提取物的制备 参照焦胜敏（2014）和唐军等（2011）的方法并略做改进，称取煮过后的连香树叶粉末50 g，加入300 mL 80%乙醇（料液比1∶6），温度60 ℃，超声波功率为302 W，超声时间30 min。按上述方法重复5次后合并提取液过滤，转至旋转蒸发仪浓缩，得浸膏20 g，得率为8%。

1.2.2 连香树水提物和乙醇提取物成分的测定 采用超高压液相色谱-飞行时间质谱仪（UPLC-TOF/MS）联用技术对连香树水提物和连香树乙醇提取物进行成分分析。色谱和质谱条件参照孙国东等（2017a）的实验方法，质量扫描范围0～800 m/z，数据采集时间42 min。

1.2.3 抗氧化作用测定

1.2.3.1 羟自由基（·OH）清除能力 用蒸馏水配制质量终浓度为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg·mL-1的连香树水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg·mL-1的Vc阳性对照溶液;用DMSO配制质量终浓度为0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 mg·mL-1的连香树乙醇提取物。参照任秋蓉等（2017）的水杨酸法测定连香树提取物对羟自由基（·OH） 的清除作用。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力 用蒸馏水配制质量终浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg·mL-1的连香树水提物和0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg·mL-1的Vc阳性对照溶液;用DMSO配制质量终浓度为0.08、0.04、0.02、0.01、0.005 mg·mL-1的连香树乙醇提取物。参照Li et al（2012）和任秋蓉等（2017）文献中的DPPH法测定连香树提取物对DPPH自由基（DPPH·）的清除作用。

1.2.3.3 超氧阴离子（O2-·）清除能力 用蒸馏水配制质量终浓度为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg·mL-1的连香树水提物和3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg·mL-1的Vc阳性对照溶液;用DMSO配制质量终浓度为0.008、0.004、0.002、0.001、0.005 mg·mL-1的连香树乙醇提取物。按照任秋蓉等（2017）文献中的邻苯三酚法测定连香树提取物对超氧阴离子（O2-·）的清除作用。

1.2.3.4 铁离子（Fe3+）还原力 连香树水提物、Vc阳性对照溶液和连香树乙醇提取物对照1.2.3.2的配制方法。参照戚建华等（2012）的方法测定连香树提取物对铁离子（Fe3+）的还原力，吸光度值越大，表示样品液的还原能力越强。

1.2.4 统计分析 采用SPSS17.0处理数据， LSD法分析显著性差异，双变量法分析相关性，Probit 法分析 IC50值，使用Microsoft Excel 2010作图。

2 结果与分析

2.1 连香树水提物和乙醇提取物成分分析

连香树水提物和乙醇提取物经UPLC-MS测定后得两种样品的总离子流图和紫外图，分别见图1和图2。在连香树水提物的总离子流图中，逐一分析了紫外吸收峰较强的物质，以4.37 min处的紫外吸收峰为例， 该时间的分子量为 286.106 9。在二级质谱中，生成的一系列碎片离子中含有153  [M+H-C8H6O2]+，与孙国东等（2017b）文献中报道的山萘酚的二级碎片离子一致，因此推测该物质为3，5，7，4-四羟基黄酮即山萘酚，分子式为C15H10O6。同理，还分析出水提物中含有苜蓿素（王凤云等，2016）、异槲皮苷（黄辉强等，2009）等黄酮类物质;在连香树乙醇提取物的总离子流图中，以3.754 min处的紫外吸收峰为例，也发现了分子量为286.103 2的化合物。在二级质谱中，根据孙国东等（2017b）文献中报道的山萘酚的二级碎片进行比对，发现了有5个相同的主要二级碎片离子，分别是287  [M+H]+， 241  [M+H-CO-H2O]+， 213  [M+H-2CO-H2O]+，165  [M+H- C7H6O2]+，153  [M+H-C8H6O2]+，可确认该物质为山萘酚。同理，还分析出了柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类物质（孙国东等，2017b）。

2.2 连香树提取物对羟自由基（·OH）的清除作用

连香树提取物对羟自由基（·OH）的清除作用见图3、图4和表1。从图3和图4可以看出，随着浓度的逐渐减小，反应物颜色逐渐变深，表明两种提取物均有清除羟自由基的作用。由表1可知，连香树水提物、Vc及乙醇提取物对羟自由基（·OH）的清除率随浓度增大而增大。在低浓度时，羟自由基（·OH）的清除率仅有6.46%～16.88%的清除率，在高浓度时达到了70%，最高为89.11%，表明几种物质对羟自由基（·OH）的清除率呈浓度依赖性。经统计软件SPSS17.0进一步分析，连香树水提物的P=0.000，r=0.994;Vc的P=0.026，r=0.921;乙醇提取物的P=0.002，r=0.985，进一步说明连香树提取物的浓度与羟自由基（·OH）的清除率均呈极显著的正相关关系。

2.3 连香树提取物对DPPH自由基（DPPH·）的清除作用

连香树提取物对DPPH自由基（DPPH·）的清除作用如圖5、图6和表2所示。从图5和图6可以看出，随浓度增大，反应物的颜色由紫色逐渐变为黄色，表明二者均有清除DPPH自由基的作用。由表2可知，连香树水提物、Vc和连香树乙醇提取物对DPPH自由基（DPPH·）的清除率呈剂量依赖性。在低浓度时，三者对DPPH自由基（DPPH·）的清除率在5.53%～12.15%之间，在高浓度时均达到90%。经统计软件SPSS17.0进一步分析，连香树水提物的P=0.040，r=0.895;Vc的P=0.013，r=0.950;乙醇提取物的P=0.016，r=0.944。三者的浓度与DPPH自由基（DPPH·）的清除率均呈显著的正相关关系。

2.4 连香树提取物对超氧阴离子（O2-·）的清除作用

连香树提取物对超氧阴离子（O2-·）的清除作用见图7、图8和表3。从图7和图8可以看出，随着浓度的增大，各浓度之间无明显颜色变化。但由表3可知，连香树水提物、Vc和乙醇提取物均有清除超氧阴离子（O2-·）的作用，清除率随浓度的增大而增大。当达到最高浓度时，三者的清除率在77.21%～87.48%范围内。经统计软件SPSS17.0进一步分析得连香树水提物的P=0.103，r=0.802，说明连香树水提物浓度与超氧阴离子（O2-·）的清除率呈正相关关系;连香树乙醇提取物的P=0.040，r=0.895;Vc的P=0.013，r=0.952，表明二者的浓度与超氧阴离子（O2-·）的清除率均呈显著的正相关关系。

2.5 连香树提取物对铁离子（Fe3+）的还原力

连香树提取物对铁离子（Fe3+）的还原力结果如图9、图10和表4。其中，图9和图10分别为连香树水提物和乙醇提取物铁离子还原力的颜色反应图，浓度从左到右依次减小。从图9和图10可以看出，随浓度增大，呈黄色的三价铁离子逐渐被还原成绿色，表明二者均有还原三价铁离子的能力。由表4可知，连香树提取物的铁离子（Fe3+）还原力呈剂量依赖性增加。低浓度时三者的还原力在0.017～0.066之间，高浓度时在0.235～0.397之间。经统计软件SPSS17.0进一步分析，连香树水提物的P=0.000 0，r=0.997;连香树乙醇提取物的P=0.000 0，r=0.997;Vc的P=0.000 0，r=0.999。三者的浓度与铁离子还原力均表现为极显著的正相关关系。

2.6 连香树水提物、乙醇提取物和Vc抗氧化作用的比较

经统计软件SPSS17.0分析，连香树水提物、乙醇提取物和Vc的抗氧化作用四个指标的IC50值见表5。由表5可知，连香树水提物和乙醇提取物的四个抗氧化指标分别与阳性Vc相比，清除羟自由基、DPPH自由基和还原铁离子的能力均弱于Vc，而清除超氧阴离子的作用强于Vc。经方差齐性检验后得两个实验组和阳性对照组的四个抗氧化指标的P值依次为0.827，0.958，0.052，0.417，均大于0.05，表明方差齐。进一步通过 LSD 单因素方差分析两个实验组与阳性对照组的清除率后可得四个抗氧化指标的P值分别为0.802，0.914，0.783，0.565，均大于0.05，说明连香树水提物组、乙醇提取物组和阳性对照组之间均无显著差异。

3 讨论与结论

本研究通过UPLC-TOF/MS技术，从连香树水提物和乙醇提取物中分别测定出三个黄酮类物质，即山萘酚、苜蓿素、异槲皮苷和山萘酚、柚皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷，其中山萘酚这个黄酮类物质是两者共有的成分。这个共有成分在连香树树皮的乙醇浸膏中（王静荣等，1999）也被鉴定，表明山萘酚是连香树提取物的主要成分。无论是植物精油（权美平等，2016）、植物水提物（曹晓虹等，2015）还是乙醇提取物（车金鑫等，2017;唐静月等，2017），其中主要的抗氧化物质大致为黄酮类、酚类、萜烯类和含氮化合物。本研究表明连香树水提物和乙醇提取物均具有抗氧化作用，可能是其提取物中多种黄酮类化合物共同作用的结果。

连香树所含化学成分丰富，其次生代谢产物的功能方面也具有重要的科研价值。本研究提取了连香树叶片中的次生代谢物，通过体外抗氧化实验研究其抗氧化作用，结果表明连香树提取物能有效清除羟自由基（·OH）、DPPH自由基（DPPH·）、超氧阴离子（O2-·）和还原三价铁离子（Fe3+）。和阳性对照Vc相比，虽然仅有超氧阴离子（O2-·）的作用强于Vc，但四个抗氧化指标的IC50值与其它天然抗氧化剂（任秋蓉等，2017;潘争红等，2016;唐静月等，2017）相比都相对较小，说明连香树提取物具有较强的抗氧化作用，可以作为一种潜在的有效的天然抗氧化剂。