芦竹的组培快繁技术研究

冼康华 苏江 付传明 黄宁珍 龚庆芳 何金祥

摘 要：  該研究以从匈牙利引进的良种芦竹带腋芽茎段为外植体，以MS为基本培养基，通过设计不同的生长调节剂配比，对芦竹腋芽诱导、继代增殖及生根培养基进行了研究。结果表明：良种芦竹初代诱导最佳培养基为MS + 6-BA 4.0 mg·L-1 + 蔗糖30.0 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1，萌发率为90.0%;继代增殖最佳培养基为MS + 6-BA 8.0 mg·L-1 + IBA 0.8 mg·L-1 + 蔗糖30.0 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1，芽健壮均匀，增殖系数为4.3/30 d，基部保留3～5个芽作为继代培养物增殖效果最佳;选择高度5.0 cm以上的植株进行生根，最佳生根培养基为1/2MS + NAA 0.2 mg·L-1 + 蔗糖20.0 g·L-1 + 活性碳1.0 g·L-1，不添加琼脂，培养1周生根率为100.0%，平均生根4条，根长2.0～4.0 cm;将所得生根苗炼苗1周，以河沙、黄泥或腐质土作为栽培基质，移栽于阴蔽度70的大棚中，1个月后移栽成活率≥98.0%;移栽于实验田中，按常规方式进行管理，当年亩产量约为5 500.0 kg。该研究结果为良种芦竹的大规模产业化应用提供了技术支撑。

关键词： 芦竹， 腋芽， 组织培养， 增殖

中图分类号：  Q943.1

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2018）01-0128-07

Techniques for rapid propagation of Arundo donax

XIAN Kanghua， SU Jiang， FU Chuanming， HUANG Ningzhen， GONG Qingfang， HE Jinxiang*

（ Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China ）

Abstract：  In order to find out the most efficient way for rapid propagation of Arundo donax， replanted at Guangxi Insti-tute of Botany from Hungary， by testing different concentrations of plant growth regulators， and stems with auxiliary buds were used as explants. The results showed that the most suitable medium for the sprouting of auxiliary buds was MS+ 6-BA 4.0 mg·L-1+sucrose 30 g·L-1 +agar 3.5 g·L-1， the germination rate could get to 90.0%. MS+ 6-BA 8 mg·L-1 + IBA 0.8 mg·L-1+ sucrose 30 g·L-1 + agar 3.5 g·L-1 was the most efficient proliferation medium， and buds were robust. The average proliferation rate was 4.3/30 d. Three or five sprouts linked together was found to be a better basic material for subculture in that they demonstrated a higher multiplying capacity. The most suitable rooting medium was 1/2MS+ NAA 0.2 mg·L-1 + sucrose 20 g·L-1 + activated carbon 1 g·L-1 with the five cm buds， in which the rate of rooting was 100% for 7 d， the average root number was four， and the length of the roots was 2-4 cm. The rooted seedings， which with roots 2-3 cm， were transplanted from culturing seedlings to fine river sand， yellow soil or humus soil after one week-days treatment， the survival percent reaches 98% after a month. The current annual yield was about 5 500 kg on one acre by regular management in the experimental field. The research provides technical support for industry application of the improved Arundo donax preliminarily.

Key words： Arundo donax， axillary bud， tissue culture， rapid propagation

芦竹（Arundo donax）为禾本科芦竹属多年生大型草本植物，丰产期高达10 m，根状茎发达。芦竹适应环境能力强，生长速度快，常被作为造纸和景观用材。20世纪以来，在能源紧张和环保意识日益受到关注的背景下，欧洲国家研究筛选了20种多年生草本植物，其中芦竹与芒草（Miscanthus spp.）、虉草（Phalaris arundinacea）、柳枝稷（Panicum virgatum）被认为是最具能源植物潜力的4种多年生牧草物种（余醉等，2009）。近年来，根据芦竹的生物学特性，其在恢复土壤退化、修复湿地重金属污染（韩志萍和胡正海，2005;韩志萍，2005，2006;韩志萍和王趁义，2007;谢龙和汪德爟，2009）以及作为新型生物质能源（王连锁等，2004;余醉等，2009;吴艳等，2016）的特性得到了研究，其利用价值和开发潜力也越来越受到人们的重视。

芦竹为无性繁殖，种子不育，常规繁殖方法为分蘖繁殖，平均繁殖系数为2.9～3.1（冉隆贤等，1998），远不能满足产业应用需求。目前对于芦竹组培快繁的报道并不多见，已见报道中芦竹的繁殖系数（叶保君和李春玲，1994）相较于传统的分蘖繁殖并无太大突破。在新的产业需求下，以产量更高、更优质的芦竹品种作为产业化生产品种，是促进芦竹产业发展的有效途径。多功能良种芦竹为从匈牙利引进的优良品种，丰产期高可达10 m，产量每年干重可达50～100 t·hm-2，而普通的芦竹品种干物质产量通常为每年30～40 t·hm-2（Eleni，2007），两相比较，引进的良种芦竹优势明显，是一个可以作为芦竹产业生产的优质品种。本研究拟在前人的研究基础上，开展良种芦竹的种苗组培快繁研究，为该良种芦竹的产业应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1  材料

本研究所用的材料为从匈牙利引种到广西植物研究所的多功能良种芦竹，产量每年干重可达50～100 t·hm-2，每年3—4月剪取生长健壮的芦竹新生幼嫩带腋芽茎段为外植体材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒 取外植体置于质量浓度为1%～3%的洗洁精水溶液中浸泡10～20 min，取出后用流水冲洗干净，再置于超净工作台上用体积浓度为70%～75%的乙醇浸泡50～70 s，取出后再置于质量浓度为0.1%～0.2%的HgCl2中浸泡8～10 min，取出，无菌水清洗 3～5 次。

1.2.2 芽的诱导 将经上述消毒步骤处理的外植体取出，置于无菌滤纸上吸干水分，剪成2～3 cm的小段，轻轻剥去腋芽外的叶鞘，每个茎段至少带1个腋芽，接种至培养基MS+6-BA 3～5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂3.5 g·L-1（pH 5.8）中进行初代诱导培养，其中，6-BA取3.0、4.0、5.0 mg·L-1三个水平，共设计三种培养基，每种培养基30瓶。接种后材料置于温度（25±3）℃、光照时间10～12 h·d-1、光照强度20 μmol·m-2·s-1的条件下培养，定期观测外植体及芽的生长情况并记录。

1.2.3 芽的继代培养 将初代培养所得的嫩芽转移至培养基MS+6-BA 7～9 mg·L-1+IBA 0.7～0.9 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂3.5 g·L-1（pH 5.8）中進行继代增殖培养，其中6-BA取7.0、8.0、9.0 mg·L-1，IBA取0.7、0.8、0.9 mg·L-1， 共组合成九种不同的培养基，每种培养基30瓶。材料置于温度（25±3）℃、光照时间10～12 h·d-1、光照强度30 μmol·m-2·s-1的条件下培养，定期观测记录丛生芽的诱发及生长情况。

1.2.4 根的诱导 将所得丛生苗分株，选择高度5.0 cm以上的植株转移至1/2MS+NAA 0.1～0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+活性炭1 g·L-1（pH 5.8）的液体培养基中进行生根培养，其中NAA取0.1、0.2、0.3 mg·L-1三个水平，共设计三个处理，每个处理10瓶。材料置于温度（25±3）℃、光照时间10～12 h·d-1、光照强度40 μmol·m-2·s-1的条件下培养。定期观测并记录生根情况。

2 结果与分析

2.1 芽的诱导

诱导芦竹腋芽时，剥除叶鞘可以极大地提高腋芽的萌发率，接种1周左右，可以看到部分茎段有腋芽萌发的迹象，培养30 d后芦竹腋芽的生长情况见表1。从表1可以看出，随着6-BA浓度的增加，芦竹腋芽的萌发率逐渐提高。当6-BA浓度为5 mg·L-1时，腋芽萌发率最高，达93.3%，但芽细弱，叶片较小，整体长势偏弱;而当6-BA浓度为4 mg·L-1时，萌发率虽稍微有所降低，但长出的腋芽更粗壮，整体长势最好（图1），说明高浓度的6-BA浓度虽可以提高腋芽的萌发率，但是对芽的生长不利，影响后期的继代增殖。因此，芦竹初代诱导时选择6-BA浓度为4 mg·L-1，诱导培养基为MS+ 6-BA 4 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1+ 琼脂3.5 g·L-1，pH 5.8。

2.2 继代增殖

将经过初代诱导获得的嫩芽从基部剪下，剪除上部茎叶，保留距基部1.5～2.0 cm部分，按3～5芽一丛，转移至添加3种不同浓度的6-BA和IBA的继代增殖培养基中，每瓶6个接种点（每个点含3个芽），30 d后观测记录，结果如表2所示。增殖系数和芽粗壮度是芦竹继代增殖过程较关键的两项参数，是影响后续继代或生根培养中种苗的数量和质量的关键参数。对芦竹增殖系数与芽粗壮度进行方差分析（表3，表4），结果发现：6-BA对芦竹增殖系数和芽粗壮度的影响差异极显著，极差分别为2.78、1.93; 而IBA对增殖系数和芽粗壮度的影响差异不影响， 极差分别为0.48、0.56， 说明在继代增殖中，6-BA是决定芦竹增殖系数大小与芽粗壮度的关键因素。具体表现为在本研究实验范围内随着6-BA浓度的增加，新增芽数量逐渐增多。当6-BA浓度为7 mg·L-1时，新增芽数最多为48，增殖系数为2.67（图2： A）;当6-BA浓度为8 mg·L-1，新增芽数最多为78，芽整体长势均匀整齐、健壮，增殖系数为4.33 （图2： B）; 当6-BA浓度为9 mg·L-1时，新增芽数最高达到90，但茎段细弱，相当部分芽叶片卷曲，植株生长杂乱（图2： C），表明较高的6-BA浓度虽能促进芽的萌发， 但对芽的生长会起到负面作用。

结合生长情况分析，虽然IBA对芦竹增殖系数和芽粗壮度的影响不显著，但随着IBA浓度升高，芽的粗壮度增加，长势也有所转好，特别是在6-BA浓度较高时，在一定程度上缓解了芽的玻璃化程度，说明IBA对芦竹芽的粗壮度、长势有促进作用。在本研究中当IBA浓度为0.8 mg·L-1时，芽整体长势均匀整齐、健壮，长势最好。综上所述，芦竹芽继代增殖的最佳培养基配方为MS+6-BA 8.0 mg·L-1+IBA 0.8 mg·L-1+蔗糖30.0 g·L-1+琼脂3.5 g·L-1。

2.3 生根培养

芦竹组培快繁过程中发现，芦竹生根容易，在继代培养基中培养一段时间亦能生根。为了提高芦竹的生根及洗苗效率，本研究以1/2MS为生根基本培养基，添加NAA浓度为0.1～0.3 mg·L-1，蔗糖20 g·L-1，活性炭1.0 g·L-1，不添加琼脂，即为液体培养基。将所得丛生苗分株，选择高度在5.0 cm以上的植株转移至生根培养基中培养1周后发现，蘆竹苗开始生根，生根率均在90%以上，其中当NAA浓度为0.2 mg·L-1时，生根率为100%，每株长根3～5条，根长2～4 cm，培养10～12 d，生根情况如图3，根系多、发达，易洗涤。因此，芦竹种苗的最佳生根培养基为1/2MS+ NAA 0.2 mg·L-1+ 蔗糖20 g·L-1+ 活性碳1.0 g·L-1。

2.4 炼苗与移栽

当芦竹组培苗根长到2～3 cm时，炼苗1周，河沙、黄泥或腐质土均可作为栽培基质，移栽于阴蔽度70的大棚中，移栽后定期浇水、追肥，1个月后观察发现芦竹幼苗成活率为98%以上，成活率较高，长势良好。移栽20 d后芦竹组培苗生长情况如图4。2015年3月，将得到的芦竹种苗直接移栽于实验田中，之后按常规管理方式进行管理（图5），成活率≥98%（移植芦竹种苗成活株数/芦竹种苗的总移植株数×100%）。于2015年11月收获，经统计，亩产量约为5 500 kg。

3 讨论与结论

芦竹是一种发展潜力非常大的新型能源植物，本研究使用的芦竹品种为从匈牙利引进的优良品种，产量可达每年干重50～100 t·hm-2，而普通的芦竹品种干物质产量通常为每年30～40 t·hm-2（Eleni，2007）。两相比较，引进的良种芦竹优势明显，是一个可以作为芦竹产业生产的优质品种。良种芦竹与普通芦竹一样，花粉败育，使用传统的繁殖方式远不能满足市场的需求。组织培养技术就成为繁殖种苗的重要手段。它具有繁殖系数高、周期短、所需空间少、可产生大量植株、除去病毒等优点。因此，研究出一套高效快速的良种芦竹快速繁殖体系，对于芦竹的产业化应用意义重大。本研究以良种芦竹新生幼嫩带腋芽茎段为外植体，通过设计不同的生长调节剂配比，对芦竹腋芽诱导、继代增殖及生根培养基进行了研究，总结集成了一套良种芦竹组培快繁技术体系，整体增殖系数为4.3/30 d，将利用该体系组培所得生根苗炼苗移栽，移栽成活率≥98.0%，当年亩产量约为5 500.0 kg，初步达到了为该良种芦竹的产业应用提供技术支撑的目的。

芦竹组培快繁的研究，国内外已有报道，但不同品种、基因型会存在较大差异。在诱导良种芦竹腋芽萌发时，已有的研究中分化培养基通常附加6-BA与IBA或IAA的组合（叶保君和李春玲，1994;冉隆贤等，1998;刘文竹和赵惠恩，2015）。而本研究发现，只添加6-BA时，便能达到90.0%的萌发率，与之前的研究结果差别不大。在继代培养中发现6-BA是决定芦竹增殖系数大小与芽粗壮度的关键因素。使用继代增殖最佳培养基MS+ 6-BA 8 mg·L-1 + IBA 0.8 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1+ 琼脂3.5 g·L-1，每个点新增芽数都能达到10～13，瓶苗长势整齐，相较于刘文竹和赵惠恩（2015）的研究结果，增殖效果更加稳定，但整体增殖系数为4.3/30 d，与之前的研究相比并未有较大的突破，还有待进一步继续研究;在继代增殖研究中还发现该良种芦竹基部保留3～5个芽增殖效果最佳。实验浓度范围内IBA虽对芦竹增殖系数大小与芽粗壮度的影响不显著，但随着IBA的添加，芽的粗壮度增加，玻璃化现象有所缓解，说明IBA对芦竹芽的粗壮度、长势有促进作用，冉隆贤等（1998）在进行芦竹组培研究中也发现了相似的现象。本研究首次在芦竹生根时使用液体培养基，结果发现在保障了芦竹高生根率的同时，清理根系残留培养基方便，减少了出苗时对植株及根系的损伤，能有效地提高幼苗的成活率，与固体培养相比，优势十分明显。另外，本研究还在继代增殖及生根阶段，适当地增加了光照强度，结果发现这一措施对提高分化芽和生根苗的长势、促进生根、增强后期出苗时种苗对外界环境的适应性可能确实起到积极的作用（郑洪立等2008），具体机理有待进一步研究。

目前，国内芦竹组培快繁通常是以茎段为外植体，获得了不错的成果，在一定程度上缩短了芦竹生产的周期，但是相对于传统扦插模式，繁殖倍数提高的不多，这对芦竹产业的发展造成了一定的限制。在新的产业需求下，以产量更高、更优质的芦竹品种作为产业化生产品种，是促进芦竹产业发展的有效途径，同时，寻求更快更有效地提高芦竹繁殖倍数的途径更是芦竹生产迫切要解决的技术难题。近年来已有利用愈伤途径来进行芦竹组培快繁的报道（陈岑等，2016;阳宴清等，2016），取得了不错的繁殖速率，但体系尚未成熟，仍有待进一步研究。在今后的研究中，可加强芦竹愈伤、胚状体等方面的研究，形成有效的再生体系，为芦竹产业化生产提供依据和参考。

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