黄藤素衍生物的合成及其抑制乙酰胆碱酯酶活性研究

2018-05-30 11:33邢志恒吕娜何忠梅郜玉钢赵岩祝洪艳杨鹤张连学
分析化学 2018年5期

邢志恒 吕娜 何忠梅 郜玉钢 赵岩 祝洪艳 杨鹤 张连学

摘 要 对黄藤素进行结构修饰,采用160~180℃高温热解使黄藤素选择性在9-位脱甲基,再分别与一系列酰氯发生酯化反应,最终获得12种黄藤素衍生物,经1H-NMR、13C-NMR分析确定了各衍生物的化学结构,分别为:9-O-苯甲酰基-黄藤素(9-O-Benzoyl-fibrauretin)、9-O-(2-甲基苯甲酰基)-黄藤素(9-O-(2-Methylbenzoyl)-fibrauretin)、9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素(9-O-(4-Methylbenzoyl)-fibrauretin)、9-O-(3,5-二甲基苯甲酰基)-黄藤素(9-O-(3,5-Dimethylbenzoyl)-fibrauretin)、9-O-(4-(氯甲基)苯甲酰基)-黄藤素(9-O-(4-(Chloromethyl)benzoyl)-fibrauretin)等共12种化合物,均为新化合物。采用以碘化硫代乙酰胆碱为底物、来源于苍蝇头部的乙酰胆碱酯酶(AChE)为酶源的体外活性测定方法,测定了黄藤素及其衍生物的AChE抑制活性。结果表明,大部分黄藤素酰氯衍生物体外AChE抑制活性均强于黄藤素,其中化合物9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素、9-O-(3,5-二甲基苯甲酰基)-黄藤素、9-O-(4-(氯甲基)苯甲酰基)-黄藤素对AChE的抑制作用显著,活性强度强于阳性药盐酸多奈哌齐,具有开发成抗阿尔茨海默症药物的潜力。

关键词 黄藤素;酯化反应;乙酰胆碱酯酶;抑制活性

1 引 言

随着全球范围内老龄化人口的增加,阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)己成为继中风、癌症、心血管疾病之后严重威胁老年人生命的一大杀手[1]。AD是以中枢神经系统内Tau蛋白高度磷酸化、β-淀粉样蛋白(β-Amyloid protein,Aβ)老年斑沉积为特征的一种神经系统进行性、退行性疾病。具有抑制体内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的药物(AChEI)可以缓解AD的症状[2],目前AChEI类制剂已广泛应用于临床治疗。已上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林(Tacrine)、利斯的明(Rivastigmine)、盐酸多奈哌齐(Donepezil)等药物虽有一定治疗作用,但均存在选择性低、副作用较大的缺点[3~5]。研究发现,从中药中提取的生物碱、香豆素、萜类、黄酮等成分均具有抑制AChE的作用[6],如石杉科植物千层塔中发现的石杉碱甲[7]、油胶树脂白松香中分离得到的8-羟基香豆素[8]、唇形科植物益母草中的二萜类化合物Leoheteronin A和Leopersin G[9]等都有显著抑制AChE活性的作用,并且副作用都相对较低。因此,从中药中寻找耐受性好、活性强、副作用小的AChEI成为国内外研究的热点。

中药黄藤为防己科(Menispermaceae)天仙藤属(Fibraurea)植物黄藤(Fibraurea recisa Pierre.)的干燥藤茎,又名天仙藤、土黄连、金锁匙、藤黄连[10]等,始载于《本草纲目》,现收载于2015年版《中华人民共和国药典》,其味苦,性寒,归心、肝经,具有清热解毒、泻火通便功效[11],主要含有生物碱类成分[12],主要活性代表成分为黄藤素,具有抗炎[13~14]、抑菌[15]、增强免疫[16]等作用。目前,黄藤素制剂在临床上主要用于治疗各种感染性疾病[17],疗效确切,使用安全。本课题组发现黄藤素体外具有显著抑制AChE活性的作用,其活性作用强度是阳性对照药盐酸多奈哌齐的50倍[18,19],但由于黄藤素分子结构中含有季铵氮,水溶性较强,故体内生物利用度较低[20]。为进一步开发利用黄藤素,本研究从中药黄藤中分离纯化得到黄藤素,对其结构进行修饰,规避开8-位C上的亲核加成反应和13-位Mannich反应引入烷基的方法[21,22],使其在9-位选择性脱甲基,分别与一系列酰氯发生酯化反应,以获得具有较强AChE抑制作用、生物利用度较高的衍生物,为黄藤的进一步开发利用以及AD新药开发提供了参考。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Angilent1220高效液相色譜仪(美国Angilent公司);AV400型超导核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司); BS124S电子天平(赛得利斯有限公司); 熔点测定仪(Yanacomicrometer); RE52-98型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);RT-6100酶标分析仪(雷杜公司);pH计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

黄藤药材购于云南昆明中药材市场,经吉林农业大学张连学教授鉴定为防己科天仙藤属植物黄藤(Fibraurea recisa Pierre.)的干燥藤茎。D101大孔树脂(天津波鸿树脂科技有限公司); 碱性氧化铝(国药集团化学试剂有限公司); ODS(FUJI Silysia Chemical高松,批号R050606); 盐酸多奈哌齐片(卫材(中国)药业有限公司); 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、碘化硫代乙酰巯基胆碱(ATCI)、Tris碱(分析纯,美国Sigma公司); 小牛血清蛋白(厦门市云鹏科技发展有限公司); 乙酰胆碱酯酶(200 U/g,来源于苍蝇头部, 上海源叶生物科技有限公司)。其它试剂均为国产分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1 乙酰胆碱酯酶溶液的配制 AChE溶于20 mL Tris-HCl(0.05 mol/L,pH=7.8)缓冲液中,再加入1 mg小牛血清蛋白稳定酶液,制得10 U/mL酶溶液。用pH=8.0的PBS稀释成0.5 U/mL的酶液,供AChE活性抑制测定方法Ellman法使用[23]。7.92 mg DTNB溶于1 mL无水乙醇中,用pH=7.0的PBS缓冲溶液定容至10 mL,制得2 mmol/L DTNB。将43.34 mg ATCI以水溶解并定容至10 mL,得到15 mmol/L ATCI溶液,在4℃保存备用。

2.2.2 盐酸多奈哌齐溶液的配制 取盐酸多奈哌齐片(批号:140607A)1片(含盐酸多奈哌齐5 mg)研细,溶于5 mL pH 8.0 的PBS缓冲溶液中,即得1 mg/mL的溶液,依次用PBS缓冲液稀释至50、25、10、5和2.5 g/mL。

2.2.3 待测样品溶液的配制 精密称取各待测样品10 mg,加入适量10% (V/V)DMSO溶解,再用pH 8.0的PBS缓冲液定容至10 mL,配成1 mg/mL待测样品原液,用PBS缓冲液稀释成100、50、25、10、5、2.5和1.25 g/mL系列溶液,经0.45 m滤膜过滤,样品溶液中DMSO终浓度均小于1%。

2.2.4 黄藤素的制备 黄藤药材2 kg,用10倍量60%乙醇回流提取2次,每次2 h,滤过,合并滤液,减压浓缩得浸膏228.3 g。将浸膏加水使溶解,通过预先处理好的D101大孔树脂柱(Φ 1000 mm×100 mm),先用3倍柱体积水洗,再用8倍柱体积40%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,干燥,得黄藤总生物碱50.6 g。取黄藤总生物碱10 g溶于95%乙醇,经碱性氧化铝柱(100~200目,200 g, Φ 880 mm ×100 mm)层析,95%乙醇为洗脱剂常压洗脱,薄层层析(TLC)检测,合并相同组分,组分Ⅰ经ODS柱(40~75 μm, Φ 420 × 36 mm),以甲醇-水(10∶90~50∶50, V/V)梯度洗脱,TLC检测,合并相同组分,分离得到纯化合物,经氢谱碳谱检测该化合物为黄藤素,纯度>95%,以其为原料进行衍生物合成。

2.2.5 黄藤素衍生物的合成 黄藤素在160~180℃真空条件下热解20 min[24],冷却至室温,用硅胶柱分离提纯(V三氯甲烷∶V甲醇∶V氨水= 8∶1∶0.1)得暗红色粉末状化合物巴马汀红碱,将巴马汀红碱溶于CH2Cl2中,缓慢滴加各种酰氯试剂,再加入三乙胺,常温条件下搅拌,待反应完全,减压回收溶剂,干燥,得粗产物。粗产物先用乙醚洗脱,再用硅胶柱分离纯化,三氯甲烷、甲醇洗脱,得黄色粉末化合物a-l,经高效液相色谱法测定各化合物纯度均大于90%。具體反应流程见图1。

得到的12个黄藤素衍生物a-l的R基团取代情况见电子版文后支持信息中图S1。

2.2.6 黄藤素衍生物乙酰胆碱酯酶抑制活性研究 参照文献[23]的方法,测定黄藤素、黄藤素衍生物以及阳性对照药盐酸多奈哌齐的对乙酰胆碱酯酶活性体外抑制率。

酶促反应条件优化:分别考察不同酶浓度(所加酶量分别为2.5、5、7.5、10、15和20 μL)、不同反应时间(5、10、15、20、25和30 min)、不同反应底物浓度(分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mmol/L)时反应体系的吸光度(OD)值变化情况,以确定最佳酶促反应条件。

最终反应体系条件如下: 96孔板中每孔加入140 μL PBS缓冲液,20 μL待测样品溶液和15 μL 0.5 U/mL酶溶液,混合均匀后在4℃保存20 min。取出96孔板每孔加入10 μL 2 mmol/L DTNB溶液和10 μL 15 mmol/L ATCI溶液,37℃反应20 min,测定405 nm处吸收值。背景对照孔用15 μL PBS缓冲液代替15 μL酶溶液,空白对照孔用20 μL PBS缓冲液代替20 μL待测样品溶液。按公式(1)计算酶活性抑制率(R):

R=A0-(AS-AB)A0× 100%(1)

其中, A0表示不加样品的吸收值;AS表示为既加样品又加酶的吸收值;AB表示为不加酶的吸收值。

黄藤素、黄藤素衍生物以及阳性对照药盐酸多奈哌齐分别设定5个梯度浓度,按照上述反应体系条件操作,测定每个孔在405 nm处的吸收值,设置三个重复孔。以样品浓度(μg/mL)为横坐标,以酶活性抑制率为纵坐标,绘制曲线,计算半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。

2.2.7 黄藤素衍生物抑制乙酰胆碱酯酶活性的动力学抑制类型的测定 选择活性最强的黄藤素衍生物9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素,测定其动力学抑制类型。配制浓度约为IC50值的待测样品溶液,按照酶活性测定方法,不同酶浓度(0、2和5 g/mL)时,测定不同ATCI底物浓度(6、9、12、15和18 mmol/L),不同反应时间(5、10、15、20和25 min)时的吸光度,以时间(t)-吸收值(A)作线性回归,可得到AChE的反应速率。再以反应速率倒数(1/v)对底物浓度的倒数(1/[S])绘制Lineweaver-Burk的曲线[25],根据对照组和实验组两直线交点位置判断其动力学抑制类型。

3 结果与讨论

3.1 黄藤素衍生物结构鉴定结果

化合物a:黄色粉末状固体; 收率为89.3%; mp:160.1~160.9; ESI-MS:m/z 443.2 [M+H]+; 1H-NMR(300 MHz, CF3COOD): δ 9.26(s,1H),8.39(s,1H),8.13(s,1H),8.11(s,1H),8.00(d,J=9.3 Hz,1H),7.91~7.88(m,1H),7.62~7.57(m,1H),7.44~7.39(m,3H),6.79(s,1H),4.69(t,J=5.7 Hz,2H),3.89(s,3H),3.88(s,3H),3.81(s,3H),3.11(t,J=6 Hz,2H); 13C-NMR(75 MHz,CF3COOD): δ 170.7(C-1'),155.3(C-3),154.6(C-2),151.8(C-13a),145.8(C-8),142.5(C-10),138.8(C-12a),137.8(C-9),137.2(C-4"),133.7(C-13),133.1(C-4a),132.5(C-2"),132.0(C-6"),130.4(C-1"),128.8(C-3"),125.1(C-5"),123.8(C-12),123.0(C-1a),122.1(C-8a),119.4(C-1),111.8(C-4),114.0(C-11),59.8(C-6),59.2(2-OCH3) 58.8(3-OCH3),58.3(10-OCH3),29.5(C-5); 以上核磁数据可以确定化合物a为9-O-苯甲酰基-黄藤素(9-O-benzoyl-fibrauretin),化学结构见图2。

其余11种衍生物的核磁共振测定数据以及化学结构图见电子版文后支持信息图S2-S12。

3.2 酶促反应条件优化结果

3.2.1 酶浓度对反应体系的影响 实验结果(图3)表明,在相同时间内,酶促反应体系在405 nm处的吸收值均与酶浓度呈正比,随所用酶量增加,水解产物生成量也随之增加; 但当酶的加入量超过10 μL时,体系吸收值的增加趋于平稳,说明底物的水解产物的量趋于稳定,反应达到平衡。因此,本实验选择酶的加入量为10 μL。

3.2.2 反应时间对反应体系的影响 实验结果(图4)表明,随酶促反应时间延长,反应体系在405 nm处的吸收值随之增大,但当反应时间达到20 min后,吸收值的变化趋于平稳。因此,本实验选择酶促反应时间为20 min。

3.2.3 底物浓度对酶反应体系的影响 由图5可见,在酶使用量一定的情况下,增加底物ATCI的浓度,反应体系的吸收值也随之增加,当底物浓度>15 mmol/L时,吸收值趋于平稳,因此选择浓度为15 mmol/L的ATCI进行酶促反应。

3.3 黄藤素衍生物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果

在上述优化的酶促反应条件下,以待测样品浓度(μg/mL)为横坐标,以酶活性抑制率为纵坐标,绘制曲线,计算各待测样品的IC50值,测定结果见表1,黄藤素及其衍生物对体外对AChE均具有一定的抑制作用,且存在显著的量效关系。

所有的黄藤素衍生物体外对AChE的抑制活性均大于黄藤素,其中化合物9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素(化合物c)、化合物9-O-(3,5-二甲基苯甲酰基)-黄藤素(化合物h)和化合物9-O-(4-(氯甲基)苯甲酰基)-黄藤素(化合物k)对AChE的抑制作用最显著,IC50分别为3.54、4.71和6.36 g/mL,对AChE的抑制活性均大于阳性对照药盐酸多奈哌齐(IC50为8.96 g/mL)。進一步分析表1中数据可以发现,当黄藤素母核中的R基团是供电子基团时,化合物的活性较大,而当R基团是吸电子基团时,化合物的活性较小。虽然化合物b和化合物g连接的是供电子基团,但由于空间位阻较大,阻止了底物与酶活性位点的结合,从而活性减弱。

3.4 黄藤素衍生物抑制乙酰胆碱酯酶活性的动力学抑制类型

采用优化后的酶活性测定方法,测定浓度约为IC50值的抑制剂对酶活力的影响,其中, 抑制作用最显著的是9-O-(4-甲基苯酰基)黄藤素。采用Lineweaver-Burk双倒数作图, 如图6所示,根据9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素对AChE的抑制作用得到一组交于第二象限的直线,并且横、纵轴截距都随化合物浓度的变化而变化; 计算各组直线的横、纵轴截距发现,随化合物浓度的增大,米氏常数Km值增大,Vmax值减小,这符合混合型抑制剂反应动力学的特点。据此可以判定化合物9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素对AChE的抑制作用为混合型抑制,即此化合物既可与游离酶结合,也能与酶-底物复合物结合。

4 结 论

采用D101大孔树脂对黄藤生物碱类成分进行了分离纯化,显著提高了总生物碱的纯度和收率。 D101大孔树脂具有性质稳定,选择性好,使用周期长等优点。采用高温热解法使黄藤素选择性在9-位脱甲基,再分别与一系列酰氯发生酯化反应,简单易行,适用于大量生产中。利用Ellman法研究了黄藤素及其衍生物的体外AChE抑制活性研究,筛选出了具有显著抑制AChE活性的衍生物9-O-(4-甲基苯甲酰基)-黄藤素, 为抗AD新药的开发提供了参考。

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