基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光传感器检测致病菌基因

邓健康 牛晓娟 刘亚青 王硕

摘 要 食源性致病菌严重威胁着公众健康。本研究基于荧光共振能量转移原理，以Cy3和Cy5作为荧光供体和受体基团，利用核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）增强检测信号，构建了比率型荧光传感器，用于高灵敏度检测致病菌基因。分别标记有Cy3的R1-DNA和标记Cy5的R2-DNA形成双链R1/R2，在Cy3的激发光波长激发下，由于发生荧光共振能量转移，Cy3的荧光被猝灭而产生Cy5的荧光信号。致病菌靶基因（大肠杆菌Lac Z 基因）的存在可将R1/R2双链解旋，使得Cy3远离Cy5，导致Cy3的荧光恢复而Cy5的荧光信号降低。在Exo Ⅲ作用下，Cy3与Cy5的信号变化进一步增大。在优化的实验条件下，荧光信号变化与靶基因在10～2000 pmol/L浓度范围内呈现良好的线性关系，检出限为5.29 pmol/L。所采用的比率型信号检测策略极大地降低了假阴性、假阳性检测结果的产生，增强了检测特异性。

关键词 大肠杆菌；致病菌基因；荧光共振能量转移；核酸外切酶Ⅲ；比率型荧光生物传感器

1 引 言

食源性致病菌被公认为是影响全球食品安全的首要问题。食品中常见的致病菌有弯曲杆菌（Campylobacter spp.）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙门氏菌（Salmonella spp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）及大肠杆菌（Escherichia coli）[1，2]。食用致病菌污染的食物可导致胃肠道疾病，严重的会损害脑及内脏器官，甚至引起死亡[3]，严重威胁着公众健康，并导致重大经济损失[4]。高灵敏检测致病菌已经成为确保食品安全和质量的重要手段。

目前常用的食源性致病菌检测方法有传统微生物检验法[5]、免疫学检测方法[6]和快速基因检测技术[7～9]等。传统的检测方法不仅操作复杂、耗时长， 且灵敏度较低，不能满足目前食品安全快速检测的要求。检测致病菌的特定序列核酸具有重要意义，发展简单、快速、灵敏度高和准确性好的致病菌基因检测方法已成为研究热点[10]。等温扩增策略已广泛应用于核酸检测中[11]，其中核酸外切酶Ⅲ信号放大是近年来采用较多的灵敏检测方法，此策略操作简便、易于设计，核酸外切酶Ⅲ无需特定识别位点，作用于双链DNA，沿3'端逐步催化去除单核苷酸，对3'突出末端双链DNA或单链DNA无活性[12]。

荧光检测方法具有灵敏度高、易操作等优势，在许多领域应用广泛。目前所发展的检测致病菌基因的荧光生物传感器通常只有单一信号输出，仅可基于检测信号增高（Signal-on）或者基于检测信号降低（Signal-off），可能会出现假阳性或假阴性的检测结果[2，5，8，9，13，14]。而具有两种荧光检测信号的比率型生物传感器则可克服以上不足。靶分子的存在会引起一种荧光基团信号增强，而另一种荧光基团信号降低，该策略不仅可提高检测灵敏度，还可增强检测特异性[14～16]。荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）原理已广泛用于检测DNA[8]、RNA[14，17]、金属离子[18]、双酚A（Bisphenol A）[19]、细菌[20]等，在生物、食品和医学等领域具有重要的意义[20]。本研究发展了一种基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光生物传感器用于致病菌基因检测，比率型检测策略提高了检测灵敏度和选择性，建立的检测方法在食品安全监管等方面具有良好的应用前景。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Lumina荧光分光光度仪、EV300紫外-可见光分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；5804R高速离心机（德国Eppendorf公司）；Bio-rad ChemDoc XRS凝膠成像系统（美国Bio-Rad公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

乙酸（HAc）、HCl、NaCl（国药集团化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、丙烯酰胺、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）、硼酸（美国Sigma-Aldrich公司）；过硫酸铵、SYBR Gold（北京索莱宝科技有限公司）；核酸外切酶Ⅲ、NE Buffer 1（美国New England Biolabs公司）。试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（>18.25 MΩ·cm）；所有核酸序列均由上海生物生工有限公司合成，其序列见表1。

2.2 实验方法

2.2.1 DNA浓度测定 DNA浓度以单链浓度表示，利用紫外-可见光分光光度计测定DNA在260 nm处的吸光度，根据朗伯比尔定律（A=εbc）计算得DNA的浓度 （ε260 nm[L/（mol cm）]： A=15400， G=11500， C=7400， T=8700）。最后配制成10 μmol/L的溶液，于20℃保存待用。

2.2.2 20%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA终浓度为300 nmol/L，施加电压为110 V，时间为2 h。聚丙烯酰胺凝胶经SYBR Gold染色30 min后进行凝胶成像。

2.2.3 样品检测 10 μmol/L R1和10 μmol/L R2，由NE Buffer 1定容，置于1.5 mL棕色离心管中，95℃下加热5 min，缓慢降至室温（降温时间至少3 h），使R1和R2序列充分杂交。将R1/R2（终浓度100 nmol/L）、不同浓度的待测样品（Lac Z）与10 U Exo Ⅲ混合，加入20 μL 10×NE Buffer 1，加水定容至终体积为200 μL，37℃孵育，酶解反应80 min后，80℃孵育20 min，使酶失活，待混合液降至室温后在512 nm激发波长下测定其的荧光发射光谱，光谱测定范围为532～750 nm，激发光和发射光狭缝宽度为20 nm。待测样品重复测定3次。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

发生有效能量转移的供体-受体对之间，要求供体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠，其能量转移效率与供体和受体之间的距离密切相关，通常发生在10 nm的距离之内[22]。本研究选择Cy3和Cy5作为荧光共振能量转移的能量供体和受体，为了验证在本实验体系下是否能满足荧光共振能量转移，分别测定了Cy3和Cy5的吸收和发射波谱。如图1所示，Cy3的最大激发波长为512 nm，在此波长激发下，Cy3的发射波长在558 nm处达到最大值，而Cy5的吸收波长范围则在532～750 nm之间，其最大发射波长为671 nm。Cy3发射光谱与Cy5的吸收光谱重叠。由此可知，荧光共振能量转移可发生在分别作为供体和受体的Cy3与Cy5之间[23]。荧光共振能量转移效率与荧光供体受体间的距离紧密相关[24]。基于DNA的距离可控性，将Cy3和Cy5分别标记在不同的DNA序列，通过调控DNA序列的碱基数可以实现供体与受体间距离的调控。

本研究以大肠杆菌基因（Lac Z 基因）为模型靶分子，检测原理如图2A所示。与致病菌基因（Lac Z）完全互补的DNA序列（R1）5'端标记Cy3染料，R1与其部分互补的DNA序列（R2）形成DNA双链（R1/R2），R2序列3'端标记有Cy5染料。R1/R2双链形成使Cy3和Cy5距离靠近，形成有效的荧光共振能量转移体系。R1/R2中的3'端突出，有效防止被Exo Ⅲ降解。在Cy3的激发波长激发下，由于FRET效应检测到Cy5的发射光谱。在Lac Z基因存在时，由于R1与Lac Z结合能力大于其与R2的结合能力，Lac Z引发Toehold介导的链置换反应（Toehold-mediated strand displacement reaction）[25]，Lac Z將R1从R1/R2双链中置换下来，从而形成R1的3'端为平末端的R1/Lac Z双链结构，使得Cy3远离Cy5，由于距离的增大消除了该荧光对之间的FRET效应，Cy5的荧光信号强度降低，而Cy3的荧光信号则增强。另一方面所形成的R1/Lac Z双链中R1为3'端为平末端，这种情况下Exo Ⅲ可将R1降解，从而释放Lac Z，释放出的Lac Z可再次与R1/R2发生链置换反应，由此引发循环反应，不断产生游离的Cy3，使得Cy3的荧光信号增强得到进一步放大，而Cy5的荧光信号则进一步被降低。基于两种荧光信号强度的比值，最终实现对致病菌基因的高灵敏度比率检测。

为验证原理的可行性，测定了反应体系的荧光光谱。如图2B所示，在R1和R2分别存在情况下，以Cy3的激发波长512 nm对体系进行激发，含有R1（标记有Cy3）的体系只检测到Cy3的荧光响应（最大发射波长位于558 nm，图2B， a），而含有R2的体系（标记有Cy5）则无明显的荧光发射响应（图2B， b），而在558 nm激发下，Cy5在671 nm处有较强的荧光响应（图2B， d）。在形成R1/R2双链后使得Cy3接近Cy5，此时以512 nm的波长激发，Cy3的发射光强度降低，而Cy5发射光强度增强（图2B， c），证明Cy3 和Cy5之间发生了荧光共振能量转移[24]。在加入致病菌Lac Z基因后，形成的R1/Lac Z中的R1被ExoⅢ降解，使得Cy3的荧光发射强度恢复，而Cy5荧光发射强度降低（图2B， e）。以上实验结果证明所设计的检测策略是可行的。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步证明了DNA序列间的相互反应。如图3所示，泳道1-3分别是Lac Z、R1和R2，R2条带染色浅，原因可能是二级构象导致SYBR Gold染色存在差异。R1和R2形成双链R1/R2后出现一条新的条带（泳道4），由于R1/R2结构不满足Exo Ⅲ发挥酶切作用的条件，因此在加入Exo Ⅲ后仍以双链形式存在（泳道8）。将Lac Z加入至R1/R2反应（泳道6），R1/R2条带消失，一个条带出现在R2位置，另一条带则出现在新的位置，与R1/Lac Z双链位置相同（泳道5），说明Lac Z成功地将R1从R1/R2中置换，形成了R1/Lac Z双链。在此基础上加入Exo Ⅲ，在酶的作用下，出现了一条较宽的条带（泳道7），由于Lac Z和R2位置接近（泳道1， 3），因此推断较宽的条带为Lac Z和R2重合的结果。上述实验结果证明，DNA链间相互反应按照所预计方式发生，再次证明所设计实验的可行性。

3.2 实验条件优化

能量供体和受体间的距离对荧光共振能量转移效率起着至关重要的作用[26]。因此，通过改变DNA序列的碱基数量对Cy3-Cy5间的距离进行了优化。本实验设计了具有不同链长的T0R2、T5R2、R2和T20R2（具体序列见表1），R1-DNA序列分别与上述DNA序列退火后充分杂交，对应形成双链R1/T0R2、R1/T5R2、R1/R2和R1/T20R2，Cy3和Cy5之间分别相距0、5、10和20个碱基。以Cy3的激发波长激发，以Cy5与Cy3的最大发射波长比值（F671/F558）为检测信号，如图4A所示，由于间隔距离不同导致Cy3和Cy5的荧光强度比值F671/F558差异较大。碱基数为10时F671/F558达到最大值，即Cy3至Cy5荧光共振能量转移效率最佳，因此，选择Cy3和Cy5之间具有10个碱基的距离用于后续实验。进一步实验证明Cy3-Cy5荧光信号比较稳定，不易受缓冲溶液影响（图4B）。因此，本研究选择适于Exo Ⅲ发挥作用的NE Buffer 1 （pH 7.0） 作为反应缓冲液。为获得最佳检测结果，对检测体系中Exo Ⅲ用量及反应时间进行优化。结果表明，Exo Ⅲ用量对检测型号放大效果有明显影响[10，27～29]。随着Exo Ⅲ用量增加，F558/F671呈增大的趋势（图4C），酶用量为10 U时，F558/F671达到最大值，酶用量为20 U时，F558/F 671不再增大，为节省成本且保证检测效果，后续实验选择10 U作为Exo Ⅲ酶反应的最佳用量。反应时间是影响酶反应效果的重要参数之一。如图4D所示，随反应时间延长，F558/F671逐渐增大，反应时间在80 min时， F558/F671达到最大值，说明反应80 min后，反应已经达到平衡。为保证酶反应充分和检测效率，选取80 min作为Exo Ⅲ酶反应的最佳反应时间。

3.3 基于比率型生物传感器高灵敏检测致病菌基因

在上述优化的实验条件下，以Lac Z基因（大肠杆菌基因）为靶基因进行定量检测。在构建的传感体系中加入不同浓度的靶基因Lac Z，随着Lac Z浓度的增大，Lac Z与更多的R1结合形成3'-平末端的Lac Z/R1双链，使R1被Exo Ⅲ酶降解，对应的Cy3荧光信号强度增强而Cy5荧光信号强度降低，释放的Lac Z可再次取代R形成双链Lac Z/R1，从而实现信号变化放大（图5A）。以F558/F671为纵坐标，Lac Z浓度为横坐标做散点图并进行线性拟合， F558/F671与Lac Z浓度在10～2000 pmol/L范围内呈线性关系（图5B），回归方程为Y=0.00428X+0.76486，相关系数R2=0.9991， 按S/N=3计算得本方法的检出限（LOD）为5.29 pmol/L。与文献[8，30～32]相比，本方法具有更好的检测灵敏度。

3.4 采用构建的比率型生物传感器特异性检测致病菌基因

为验证本检测方法的特异性，选取其它致病菌基因序列（nuc A基因（金黄色葡萄球菌）[33]、inv A基因（沙门氏菌）[9]、eae A基因（大肠杆菌O157：H7）[13]和mec A基因（金黄色葡萄球菌）[8]）进行验证。如图6A所示，只有靶基因Lac Z可引起明显的信号变化，而所构建传感体系对其它致病菌基因没响应，证明其对Lac Z基因具有良好的选择性。另外，所构建生物传感器具有良好的区分碱基错配的能力。如图6B所示， 单碱基错配的DNA（M1）序列引起的传感体系信号的变化明显低于靶基因引起的信号变化，而双碱基错配（M2）、三堿基错配（M3）及四碱基错配（M4）的DNA序列引起的荧光信号变化更低。

4 结 论

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ信号放大的比率型荧光传感器，可用于高灵敏度、高特异性检测致病菌基因。通过调控DNA序列，对荧光受体-给体对（Cy3-Cy5）之间的距离进行了可控调节，确定了最优距离，提高了共振能量转移效率，有利于检测灵敏度的提高，对荧光共振能量转移生物传感器的构建具有一定的参考意义。与酶切信号循环放大策略相结合，进一步提高了检测灵敏度，LOD值为5.29 pmol/L。 所构建生物传感器表现出良好的特异性，可对不同致病菌基因及碱基错配序列进行区分。比率型生物传感器的构建还有利于降低外界环境对检测体系的影响，从而提高检测准确性。本方法为食源性致病菌高灵敏度高特异性检测提供了有益参考。

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