多参数高场强磁共振成像评估恒河猴急性脑梗死血栓-溶栓模型

张 默，吴 迪，何小夺，齐志刚，李坤成*，陈 健(.首都医科大学宣武医院影像科，北京 0005； .首都医科大学宣武医院中美神经科学研究所，北京 0005； .首都医科大学宣武医院神经外科，北京 0005)

脑血管病是危害人类生命健康的最常见疾病之一，其中缺血性脑血管病(ischemia cerebrovascular disease，ICVD)约占全部脑血管病的80%，具有死亡率和致残率高的特点[1]。采用重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)进行溶栓治疗是唯一被证实治疗卒中的有效方法[2-3]。但是，在非人灵长类动物(nonhuman primates，NHPs)上模拟急性脑梗死发病、治疗的模型鲜有报道。恒河猴与人类亲缘关系密切，在器官代谢功能、体格特点及基因遗传水平等许多生物学特性方面与人类较为接近，因此成为近年来各种药物、疾病的病理生理机制研究的重要模型[4]。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术作为一种无创检查技术，已成为脑梗死的重要检查手段，甚至是首选检查方案。其中常规扫描T2加权图像(T2WI)可用于观察病变；T2磁共振成像液体衰减反转恢复序列(T2-FLAIR)可在T2WI中抑制脑脊液的高信号，使邻近脑脊液、具有高信号(长T2)的病变得以显示清楚；使用时间飞跃法血管成像技术(TOF-MRA)可无创得到大脑内血管图像；弥散加权成像(diffusion-weighted imaging，DWI)等已经被较多地应用于脑梗死的研究之中[5]。本研究建立了大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，并对其进行溶栓治疗，通过磁共振技术观察梗死区域组织及血流变化，比较不同治疗时长的疗效，以期指导临床治疗。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年雄性恒河猴8只，清洁级，平均年龄(8.2±1.2)岁，平均体重(9.4±1.0) kg，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[SCXK (军) 2012-0019]。动物日常喂养在首都医科大学实验动物室[SYXK (京) 2014-0018]，每只动物均单独饲养，购买后喂养一个月以上方用于实验。所用实验动物经检测排除结核、志贺氏菌、沙门氏菌、寄生虫、B病毒感染等疾病。其中4只动物接受血栓注射(梗死组)，其余4只动物接受溶栓治疗(溶栓组)。实验方案经首都医科大学动物伦理委员会批准(AEEI-2016-174)。

1.2 主要试剂与仪器

所用麻醉药品：丙泊酚(10 mL/100 mg，批号：320040，AstraZeneca UK Limited)；氯胺酮(2 mL/0.1 g，批号：111207，江苏恒瑞医药股份有限公司，中国)；速眠新(批号：201403，广州莱绿宠商贸有限公司，中国)。

实验所用磁共振设备为Simens公司生产的Verio 3T超导磁共振扫描仪，搭配使用Simens 32通道头部线圈；使用Simens Syngo后处理工作平台对数据进行处理。其他器材包括微导丝(Traxcess 14，Microvention，美国)；Rebar 18微导管(Micro Therapeutics，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 恒河猴大脑中动脉栓塞模型的建立[6]

模型动物术前8 h禁水，2 h禁食，对实验动物的生命体征全程监测，手术台通过电热毯辅助加热，动物肛温控制在37℃，肌内注射氯胺酮(2 mL)+速眠新(1 mL)诱导麻醉，丙泊酚0.3～0.4 mg/(kg·h)持续静脉滴注麻醉。手术过程中，对体温、心率、有创动脉压、呼吸、血氧饱和度进行持续监测，间断进行血气分析。固定恒河猴于仰卧位，头部正位。采用冠状动脉造影用5 F动脉鞘组穿刺针、导引钢丝、动脉鞘行经皮穿刺股动脉。在0.889 mm(0.035英寸)超滑导丝引导下，将5 F导引导管置入右侧颈内动脉。退出导丝后，行右侧颈内动脉正侧位造影。使用微导，并将微导管头端置入至右侧M1段。退出微导丝，手推造影剂碘海醇2 mL，造影证实微导管头端位于大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)近段。通过注射器将一根10 cm自体血栓打入微导管。局部脑缺血后2.5 h开始给予rt-PA溶栓治疗。直视下缝合右侧股动脉穿刺处，缝合皮下组织及皮肤，加压包扎后将动物送回动物房。视动物术后状态，静脉滴注甘露醇等对症治疗，并给予保温、营养等生命支持。

1.3.2 磁共振扫描方法

实验前，对实验对象进行磁共振扫描，排除病变之后，对8只恒河猴分别进行M1段梗死模型的制备。实验分为两组，梗死组不进行溶栓，溶栓组进行rt-PA溶栓治疗。分别于术后4 h及24 h进行磁共振扫描，扫描序列包括T2WI(TR=4000 ms，TE=100 ms，FOV=180 mm)，T2-FLAIR(TR=9000 ms，TE=96 ms，FOV=220 mm)，TOF-MRA(TR=20 ms，TE=3.6 ms，FOV=220 mm)，DWI(TR=6000 ms，TE=100 ms，FOV=220 mm)。分别在局部脑缺血后4 h和24 h进行MRI扫描。使用后，处理工作站计算4 h和24 h的梗死体积(包括T2WI，T2-FLAIR和DWI)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大脑中动脉栓塞恒河猴表现

术后模型动物均恢复自主呼吸，出现对侧神经功能受损，表现为对侧上肢和下肢无力，仅能用正常侧上肢进行抓取动作；对侧上肢和下肢感觉功能障碍，对痛觉刺激无反应；模型动物在进食过程中均出现流涎症状。

2.2 评估大脑中动脉灌注情况

MRA显示，注射血栓后4 h梗死组大脑中动脉主干闭塞，24 h梗死组大脑中动脉主干仍未再通(图1)。经溶栓治疗后，注射血栓后4 h溶栓组的大脑中动脉主干实现再通，24 h溶栓模型大脑中动脉主干仍为再通状态。

2.3 梗死体积评估

T2WI序列显示，梗死组4 h、24 h的梗死体积分别为(2665±1519) mm3和(14 693±5078) mm3，溶栓组4 h、24 h的梗死体积分别为(2738±958) mm3和(7648±3101) mm3；梗死组梗死体积增量为(12 027±5507) mm3，溶栓组梗死体积增量为(4910±2764) mm3；两组4 h梗死体积比较，差异无显著性；溶栓组24 h梗死体积及4～24 h增量低于梗死组，差异有显著性。见图1、图2、图3。

DWI序列显示，梗死组4 h、24 h的梗死体积分别为(8017±3593) mm3和(17 515±6024) mm3，溶栓组4 h、24 h的梗死体积分别为(5988±3032) mm3和(10 842±3529) mm3；梗死组梗死体积增量为(9498±5226) mm3，溶栓组梗死体积增量为(4854±1792) mm3；两组4 h梗死体积比较，差异无显著性；溶栓组24 h梗死体积及4～24 h增量低于梗死组，差异有显著性。见图1、图2、图4。

3 讨论

脑缺血动物模型是研究脑血管疾病损伤机制和防治措施的基础，尤其是近期许多大脑保护药物临床III期的失败，更显示出适当的动物模型对于脑梗死研究的重要性。啮齿类动物的脑梗死模型过于简单，与人类之间有着巨大的种属差异[7]，不足以反映人类脑梗死的复杂性和动态变化。而非人灵长类动物在基因上非常接近于人类，其大脑的解剖结构，特别是大脑中动脉的分布区域与人类相似，而且脑的大小也适合进行MRI研究，因此美国卒中治疗专业委员会建议，新的神经保护药物进行临床试验之前，应该以非人灵长类动物梗死模型作为动物模型进行临床前研究[8]。

注：从左至右依次为TOF-MRA，T2WI，DWI，T2-FLAIR。图1 梗死组4 h、24 h磁共振影像Note.From left to right, figures show TOF-MRA, T2WI, DWI, and T2-FLAIR images, respectively.Fig.1 MRI of the infarction group at 4 h and 24 h

注：从左至右依次为TOF-MRA，T2WI，DWI，T2-FLAIR。图2 溶栓组4 h、24 h磁共振影像Note.From left to right, figures show TOF-MRA, T2WI, DWI, and T2-FLAIR images, respectively.Fig.2 MRI of the thrombolysis group at 4 h and 24 h

图3 T2WI序列显示梗死组和溶栓组在4 h、24 h的梗死体积及梗死体积增量Fig.3 Volume with increases of cerebral infarction by T2WI in the infarction group and thrombolysis group at 4 h and 24 h

图4 DWI序列显示梗死组和溶栓组在4 h、24 h的梗死体积及梗死体积增量Fig.4 Volume with increases of cerebral infarction by DWI in the infarction group and thrombolysis group at 4 h and 24 h

大脑中动脉(MCA)是人类脑缺血的多发部位，绝大多数的脑缺血模型都是针对MCA展开的。非人灵长类动物局部脑缺血模型的建立方法可大致分为血管内介入方法和开颅手术方法，Marshall等[9]研究指出，恒河猴血栓-溶栓模型与卒中患者发病治疗过程一致。在各种模型制作方法中，血管内介入方法的模型制备过程与脑卒中的发病过程非常相似，因此值得特别关注[10]。但是，由于技术等原因，采用血管内介入方法制备急性脑缺血模型的报道非常少。本实验采取的血栓模型，同时模拟了血栓发生过程和干预治疗的过程，更适合用来评估干预效果[11]。

目前，3T场强的高场强磁共振扫描仪用于诊断急性脑血管病及其并发症，已经在临床上得到了广泛开展。非人灵长类动物体型与人类婴幼儿相近，配合高通道数的32通道头部线圈和GRAPPA并行采集技术的使用，可以在保持较高空间分辨率的情况下，同时大幅度缩短扫描时间，得到清晰准确的图像，也允许在较短的时间窗内，获得更多模态的MRI图像[12]。通过TOF-MRA扫描，可以准确观察到，在梗死模型制备并进行溶栓后，实验侧血管的再通情况以及与正常侧血管形态的对比。在梗死模型制备后，实验侧的血流明显减少，梗死组动物的实验侧血管于血栓位置截断，4 h和24 h时远端血管都不能显示。溶栓组进行溶栓再通后，远端血管恢复血流，4 h和24 h均保持可见，明确了溶栓操作的效果。

磁共振弥散加权成像(DWI)可以无创地检测活体组织内的水分子自由扩散运动，在临床上，主要应用于诊断超早期脑缺血，脑组织急性缺血后，因为脑供血不足，导致微循环灌注障碍，致使细胞缺氧，ATP生成减少，钠钾泵衰竭，导致K+外流，Na+、Cl-、Ca2+内流，细胞内渗透压增高，大量水分子进入细胞，产生细胞毒性水肿，导致水分子自由扩散运动异常，DWI表现为病灶区域出现异常高信号。与常用FSE序列相比，可以更早地确定缺血病灶位置[13 - 14]。

通过工作站分别计算梗死组和溶栓组4 h、24 h不同时间点的T2WI以及DWI图像中的梗死体积，可以发现梗死组与溶栓组于4 h时显示的梗死面积并无较大差异，而24 h时，T2WI、DWI图像显示，两组实验动物的大脑血管状态有明确的不同，梗死体积有显著的差异。由此可以得出，通过多参数高场强磁共振成像，可以对梗死-溶栓模型的建立效果进行准确的评价。

随着血管内介入方法制作血栓模型的开展，这种方法虽然有接近临床发病和治疗的优点，但是仍然存在血栓模型定位不够精准，血栓延伸、血栓自溶等不确定因素[14]，仍然需要建立一套完善的模型评价体系。而伴随磁共振技术向着高场强及超高场强、高梯度性能和多种图像对比的发展，为血栓梗死及溶栓模型的评价提供了丰富的信息，对于评价体系的建立有极大的帮助。今后的研究应采用更多的磁共振技术，如磁共振灌注成像PWI及磁共振磁敏感成像SWI等，在定性评价的同时还能定量地评价血栓模型。

近些年来，联合动脉选择性低温灌注技术，在临床上仍处于初步的研究阶段。目前，已有研究人员应用于猪及犬等的动物模型上[15-16]，取得了较为积极的治疗效果。能否在非人灵长类动物模型中得到验证，将是下一步研究的重点。

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