绵羊多羔候选基因的研究及应用进展

田志龙 ，王玉琴 ，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003）

绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受诸多因素的影响。截止目前，国内外学者已对影响绵羊产羔数的众多候选基因进行了深入研究，包括但不限于：骨形态发生蛋白受体1B（Bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B，FecB）、骨形态发生蛋白 15（Bone morphogenetic protein 15，BMP15，FecX）、生长分化因子 9基因（Growth differentiation factor-9，GDF9，FecG）、糖基化酶β-1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶 2（Glycosylation enzyme beta-1，4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2，B4GALNT2，FecL）、雌激素受体（Estrogen receptor，ESR）、孕酮受体（Progesterone receptor，PGR）等，这些基因在调控绵羊产羔性状方面起到至关重要的作用［1］。目前全世界仅有少量绵羊品种产羔率能达200%，大多数绵羊都是季节性发情、单羔品种。同时绵羊产羔性状的遗传力较低（仅为0.1左右），常规的育种技术在短期内很难改良此性状。本文介绍了几个影响绵羊产羔数性状的重要基因的研究进展，以期为进一步提高绵羊产羔数进而提高经济效益寻求有效途径。

1 骨形态发生蛋白受体1B基因（BMPRIB）

骨形态发生蛋白受体1B位于绵羊第6号染色体，是骨形态发生蛋白的膜受体，属于转化生长因子-β（Transforming growth factor-beta，TGF-β）超家族的成员，在动物机体各组织中广泛存在，但主要在卵巢卵母细胞和颗粒细胞中表达。绵羊BMPR1B基因cDNA全长3 255 bp，由11个外显子和10个内含子组成，共编码502 个氨基酸。1982 年，Davis等［2］对澳大利亚 Booroola羊进行研究时发现了一个显著影响绵羊排卵数和产羔数的基因突变，在1989年时正式命名为FecB基因。Souza等［3］研究表明，FecB基因位于BMPR-1B基因上，是BMPR-1B基因编码区第746位发生A-G的突变，引起第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸（Q249R），最终导致绵羊排卵数增加。FecB基因是第一个被发现的绵羊高繁殖力主效基因，与绵羊排卵数和产羔数的增加紧密相关［4］。一个FecB基因拷贝可以增加排卵数1.3～1.6枚，产羔数增加0.9～1.2只；两个FecB基因拷贝可以增加排卵数2.73枚，产羔数增加1.1～1.7只［5］。继布鲁拉羊中发现FecB基因之后，进一步的研究发现，在亚洲绵羊品种中FecB基因的分布较为广泛。印度Kendrapada 绵羊［6］、Garole 绵羊和 Bonpala 绵羊［7］，印度尼西亚的 Javenese 羊［8］，伊朗的 Kalehkooh 绵羊［6］，中国的湖羊［9］和小尾寒羊［10］等绵羊品种均存在该基因。刘秋月等［11］对中国10个地方绵羊品种、3个培育品种绵羊的FecB基因频率进行了检测，为多羔绵羊品种改良提供了参考数据。另外，其他学者发现滩羊［12］、洼地绵羊［13］、多浪羊［14］、策勒黑羊［15］、阿勒泰羊［16］、巴音布鲁克羊［17］、鲁西黑头羊［11］等群体中均存在 FecB 基因。Chen 等［18］利用FecB基因效应，使用小尾寒羊和杜泊羊进行杂交培育多羔新品系，杂交后代平均产羔数显著高于杜泊羊（P＜0.05）。Zhang等［19］使用 CRISPR/Cas9 技术对绵羊胚胎进行体外处理，为绵羊BMPR-IB基因编码建立了技术基础。

2 骨形态发生蛋白15基因（BMP15）

骨形态发生蛋白15同属于转化生长因子β超家族成员，通过卵母细胞旁分泌途径调节卵泡发育［20］。绵羊BMP15基因位于X染色体上，cDNA序列全长1 182 bp，由两个外显子和一个内含子组成，共编码393个氨基酸，有25个氨基酸组成的信号肽、244个氨基酸前导肽和125个氨基酸的成熟肽［20］。近些年来，BMP15基因突变位点被不断地挖掘，绵羊 BMP15 基因突变（FecXI［21］、FecXH［21］、FecXG［22］、FecXB［23］和 FecXL［23］）和 序 列 缺 失FecXR［24-25］中任意一个突变杂合的母羊都具有较高的排卵数，而突变纯合母羊则由于卵泡发育受阻而不育。

Galloway 等［21］研究发现，Inverdale 绵羊 BMP15 基因FecXI点突变和Hanna绵羊BMP15基因FecXH点突变；FecXI突变是BMP15基因编码区第92核苷酸处发生T→A颠换，使蛋白质高保守区缬氨酸变成天冬氨酸（V31D）；FecXH突变是BMP15基因编码区67核苷酸处发生C→T转换，导致第23号氨基酸残基由谷氨酸变成终止密码子（Q23Ter）。Hanrahan 等［22］在 Belclare绵羊和Cambridge绵羊BMP15基因编码区发现了FecXG点突变，在Belclare绵羊BMP15基因编码区发现了FecXB点突变；FecXG突变又称B2突变，是BMP15基因编码区第2外显子718核苷酸处发生C→T转换，使肽链编码区239位氨基酸由谷氨酰胺变成了终止密码子（Q239Ter）；FecXB突变又称B4突变，是BMP15基因编码区第2外显子1 100核苷酸处发生的G→T颠换，使成熟肽链99位氨基酸由丝氨酸变成了异亮氨酸（S99I）。Bodin 等［23］发现了 Lacaune 绵羊 BMP15 基因的FecXL点突变，该突变是BMP15基因编码区第2外显子第321核苷酸处发生的G→A转换，使成熟肽链的第53位氨基酸由半胱氨酸变成了酪氨酸（C53Y）。FecXL基因突变杂合子排卵数比野生型增加了1.34个，突变纯合个体则不育。2008 年，Monteagudo 等［24］和 Martinez-Royo等［25］几乎同时发现了BMP15基因与繁殖力相关的第6个突变FecXR，即西班牙Rasa Aragonesa绵羊BMP15基因第2外显子第525～541位缺失17个核苷酸，该突变导致终止密码子提前出现和成熟肽丢失，使第2外显子完全丧失功能；突变杂合子母羊具有高繁殖力，产羔数为2.66只/胎，而野生型Rasa Aragonesa绵羊平均产羔数为1.36只/胎，突变纯合子母羊由于卵巢没有初级卵泡而导致完全不育。Demars等［26］以不同繁殖力的法国Grivette绵羊和波兰Olkuska绵羊群体为研究材料，采用全基因组关联分析，分别在两群体中鉴别出了BMP15基因的FecXGr和FecXO突变。FecXGr是法国Grivette绵羊BMP15基因编码序列第950位发生C→G，FecXO是波兰Olkuska绵羊BMP15基因编码序列第1 009位发生A→C突变。两个突变位点分别导致绵羊BMP15氨基酸序列第317位的苏氨酸转变为异亮氨酸（T317I）和第337位的天冬酰胺转变为组氨酸（N337H）。在法国Grivette绵羊群体中，FecXGr突变纯合体平均窝产羔数为2.50只±0.65只，显著高于杂合体的平均窝产羔数1.93只±0.42只和野生型个体的平均窝产羔数1.83只±0.41只（P＜0.05）；而杂合体与野生型个体的平均窝产羔数差异不显著（P＞0.05）。波兰Olkuska绵羊群体中，FecXO突变纯合体的排卵数为3.28枚±0.85枚，显著高于杂合体的排卵数2.02枚±0.47枚和野生型个体的排卵数 1.52枚±0.26枚（P＜0.05）；而杂合体与野生型个体排卵数差异不显著（P ＞0.05）。Zamani等［20］使用 PCRSSCP技术和DNA测序方法发现了影响Mehraban和Lori绵羊产羔数的BMP15基因G→A新突变，该突变位于BMP15基因第2外显子上，突变杂合母羊产羔数显著高于野生纯合母羊。董新龙等［27］通过PCR-SSCP技术和DNA测序发现，在小尾寒羊、湖羊等16个绵羊品种中不存在BMP15基因FecXGr和FecXO以及G→A突变位点。Lassoued 等［28］通过 DNA 测序，在 Tunisian Barbarine绵羊发现一种BMP15基因新的复合型突变并命名为FecXBar，该复合突变是Tunisian Barbarin绵羊编码序列第301位发生G→T突变，第302位和304位发生碱基缺失（302-304delCTA），第 310位发生碱基插入（310insC），导致氨基酸第101处发生移码突变，该突变杂合个体有较高的产羔数，突变纯合个体由于卵泡发育受阻而发生不育现象。

3 生长分化因子9基因（GDF9）

生长分化因子9属于转化生长因子β超家族成员。GDF9是卵泡生长过程中所必需的细胞因子，主要在卵巢卵母细胞表达［29］。绵羊GDF9基因位于5号染色体，由2个外显子和1个内含子组成，编码453个氨基酸。Juengel等［30］发现GDF9对绵羊正常卵泡的生长发育是必需的。GDF9基因缺陷型母羊卵母细胞可发育，但停止在初级卵泡阶段，并且卵泡周围的颗粒细胞异常表达［31］。

Hanrahan等［22］在Belclare绵羊和Cambridge绵羊GDF9基因第2外显子上发现8个单核苷酸多态（G1～G8）。其中有3个核苷酸改变但氨基酸没有发生变化，分别是位于编码区471 bp处的C→T（G2突变）、477 bp处的G→A（G3突变）和978 bp处A→G（G5突变）；4个G→A突变引起了氨基酸的变化，分别是位于编码区260 bp处的突变导致第87位由Arg变为His（G1突变），721 bp处的突变导致第241位由Glu变为Lys（G4突变），994 bp处的突变导致第332位由Val变为Ile（G6突变），1 111 bp处的突变导致第371位由Val变为Me（tG7突变）；另外1 184 bp处的C→T碱基突变导致第395位由Ser变为Phe（FecGH或G8突变）。FecGH突变纯合子Cambridge绵羊和Belclare绵羊是不育的，但杂合子的排卵数比野生型多。McNatty等［32］认为这是因为FecGH突变破坏了GDF9蛋白与TGF-β受体1的结合。Melo 等［33］在巴西 Santa Ines（SI）绵羊 GDF9 基因上发现FecGSI突变，该突变是GDF9基因编码区第2外显子1 034 bp处T→G突变，导致GDF9成熟肽第345位由Phe改变为Cys（F345C）。FecGSI突变纯合子SI绵羊黄体数高于杂合子和野生型，但是杂合子和野生型之间无显著差异。Nicol等［34］发现，FecI（FecTT）是由于冰岛Thoka绵羊GDF9基因第2外显子编码区1 279位发生A→C突变（A1279C），导致编码GDF9蛋白第109位丝氨酸改变为精氨酸（S109R），使得突变纯合子母羊不育，杂合子母羊产羔数比野生型多。Silva等［35］在多羔巴西SI绵羊上同样发现了该突变，命名为FecGE（Embrapa）。该突变纯合子母羊可育，纯合子母羊排卵数比杂合子和野生型增加 82%。Juengel等［36］报道，Thoka突变杂合子绵羊排卵数和产羔数增加，突变纯合子不育。Mullen 等［37］研 究 认 为 ，Belclare 和 Cambridge 绵 羊 中FecGH突变可能来源于Lleyn绵羊。Vage等［38］发现，在挪威白绵羊中G7突变与产羔数之间的相关性很强。Mullen 等［39］发现，GDF9 基因 G7（FecGF）突变与芬兰绵羊排卵数之间没有显著关联，但Belclare绵羊排卵数和G7 突变之间极显著相关（P＜0.01）。Souza等［40］在 Ile de France绵羊GDF9基因编码区检测到943 bp处发生C→T突变（FecGV），并导致GDF9蛋白第315位氨基酸由精氨酸变为半胱氨酸。FecGV突变杂合子排卵数比野生型增加0.86个；产羔数比野生型增加0.32只，突变纯合子母羊由于子宫和卵巢发育不全而不育。左北瑶等［41］在德国肉用美利奴羊中并未检测到G8和FecTT突变，但是检测到G1突变。金慧慧等［42］在我国高繁殖力绵羊品种小尾寒羊和湖羊中均未检测到G7突变。雷梦媛等［43］在湖羊、小尾寒羊等绵羊品种中均未检测到FecGE突变。潘章源等［29］在小尾寒羊、策勒黑羊等绵羊品种上的研究发现，11 个绵羊品种均不含 FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突变，除草原型藏羊外，其余绵羊品种均有G1突变。GDF9基因G1突变可能与我国地方绵羊品种多羔性状存在一定关系，但具体效应需要进一步研究。

4 糖基化酶β-1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2（B4GALNT2）

BMPR1B、BMP15和GDF9基因都属于转化生长因子 B（Transforming growth factor β，TGF-β）超家族。而最近鉴定出的FecL基因是唯一一个不属于这个家族的多羔主效基因。FecL基因最初被命名为Lacaune，Lacaune对排卵数的增加与BMPR-IB基因相似，有增强效应，杂合子增加排卵1.0个，纯合子增加排卵2.0个，Lacaune的突变体被命名为FecL，突变位点被命名为FecLL。Bodin等［44］通过选育构建Lacaune绵羊家系，为多羔主效基因定位打下了坚实的基础，2002年，通过基因组扫描将FecLL定位在11号常染色体上。2009年Drouilhet等［45］将 FecLL定位于 BM17132和 DLX3约 1.1Mb的区间内。2013年Drouilhet等利用高通量测序结合生物

信息学确定FecL基因为：Glycosylation Enzyme Beta-1，4-N-Acetyl-Galactosaminyltransferase 2（B4GALNT2），其中 g.36938224T＞A和 g.37034573A＞G两个标记与FecLL位点完全连锁。这两个SNP都位于B4GALNT2基因的内含子中，可能的机制是突变导致了B4GALNT2基因在卵泡中的异位表达，同时发现编码区第803位存在A→G突变，B4GALNT2蛋白在颗粒细胞中的高表达会使卵泡中特定靶蛋白的糖基化状态改变，进而引起了排卵数的改变［46-47］。这一发现揭开了除TGF-β信号通路之外调控绵羊排卵数的全新机制。

5 候选基因协同作用

5.1 BMPR-IB和BMP15基因对绵羊繁殖性能的协同效应

骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）属于TGF-β超家族成员，在动物机体中广泛分布。在哺乳动物的繁殖和免疫中起着至关重要的作用。Davis等［48］报道，Booroola 和 Inverdale 突变的双杂合个体排卵数比单基因突变多，暗示它们共用信号通路。Moore等［49］报道BMPRⅡ在抑制BMP15对FSH诱导的孕酮产量和颗粒细胞生物活性方面最有效。Chu等［50］研究发现，BMPR-IB基因和BMP15基因对小尾寒羊的产羔数存在协同效应。

5.2 GDF9与BMP15基因对绵羊繁殖性能的协同效应

Liao等［51］发现，BMP15 和 GDF9 可以形成同源和异源二聚体，引起绵羊排卵数变化，从而共同影响绵羊繁殖性能。Hanrahan 等［22］发现，同时具有 BMP15（B2 或 B4）和GDF9（G8）突变的杂合子Belclare母羊和Cambridge母羊排卵数显著增加（P＜0.05）。首次发现GDF9和BMP15基因突变均存在的绵羊具有更高的排卵数，表明BMP15突变和GDF9突变对绵羊排卵数具有加性效应。表1列出了同时含有2个高繁殖力主效基因的绵羊品种。

表1 同时携带2个高繁殖力主效基因的绵羊品种

6 其他候选基因

6.1 雌激素受体基因（ESR）

雌激素受体和孕激素受体都属于类固醇核受体超家族［55］。雌激素是一类主要在动物卵巢内合成的甾体类激素，作用于动物生殖系统［56］和中枢神经系统［57］。雌激素通过雌激素受体行使生理功能［58］。雌激素受体α（ERα）也称为NR3A1，是雌激素受体的两种主要类型之一。绵羊ERα由基因ESR1编码，具有调控转录蛋白质的功能［59］。ESRα与雌激素结合后，对胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生长发育都发挥着重要作用［60］。毕晓丹等［61］对ESR基因外显子1的研究结果表明，小尾寒羊ESR基因突变型（AB和BB）比野生型（AA）分别多产羔0.51只和0.70只（P＜0.05），推测ESR基因是控制小尾寒羊多羔性状的主效基因。狄冉等［62］对6个绵羊品种的ESR基因外显子4进行PCR-SSCP检测，发现该部分序列比较保守，推测该区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。董文艳［63］对湖羊ESR基因进行检测，结果发现ESR基因第1外显子363位发生C→G突变；产羔数统计发现突变杂合子和突变纯合子湖羊产羔数比野生型湖羊分别多0.98只和1.47只（P＜0.01）。郭海燕等［64］利用PCR-SSCP技术结合基因测序对湖羊ESR基因进行多态性检测及产羔数关联分析，发现ESR基因多态对湖羊产羔数没有影响。

6.2 孕酮受体基因（PGR）

孕激素主要在雌性动物卵巢中产生，在促进子宫发育、抑制子宫肌层收缩、卵母细胞成熟、释放以及受精卵植入子宫和妊娠维持的过程中发挥着重要作用［65］。孕激素受体（PGR）也称为NR3C3，其与孕激素结合后发挥生理功能［66］。孕激素受体是类固醇激素核受体家族成员，通过与DNA特定序列结合，从而调节雌性动物生殖生理过程［67］。绵羊PGR基因位于15号染色体，基因全长140 kb左右，由8个外显子和7个内含子组成，在动物的发育、生殖、内环境稳态中起着十分重要的作用［68］。张利平［69］以小尾寒羊为试验对象，对其PGR基因外显子4的多态性进行了检测，其AA、AB和BB基因型频率分别为0.57、0.32和0.11。查丽莎［70］对小尾寒羊的PGR基因研究发现，其GG型和AG型产羔数均值分别比 AA 型的多 0.97只（P＜0.05）和 0.64只（P＜0.05），GG型和 AG 型产羔数差异不显著（P ＞0.05）。俞理辉［71］使用SSCP-PCR技术对7个绵羊品种PGR基因外显子4进行检测，结果发现PGR基因第4外显子扩增序列的第227 bp处发生了C→T的碱基突变，该突变在小尾寒羊中存在3种基因型，但属于低度多态，选择的潜力较小。

7 展望

目前对绵羊多羔性状候选基因的研究多集中在TGF-β家族和BMP信号通路或与之相关的信号通路。除此之外，应适当关注与BMP信号通路无关的基因，如Drouilhet团队关注的FecL基因、储明星团队研究的KiSS1/GPR54/IGF1基因等与小尾寒羊产羔数的关系。绵羊产羔数是涉及多基因的复杂数量性状，因此下一步进行多基因或位点联合分析是很有必要的。现在绵羊多羔候选基因的结构、功能和调控机制尚不明确，在基因与基因、基因与环境之间的相互作用，以及基因遗传效应分析方面同样进展甚微。因此，需要使用新技术来识别并确定不同品种或群体中主效基因或与之相关的基因突变对绵羊繁殖性能的影响。使用诸如SNP芯片、GWAS、全基因组重测序和全转录组图谱、单细胞测序等技术来挖掘新的与绵羊繁殖性状相关的基因、突变或信号通路。

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